본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
살아있는 세포가 기계적 힘을 감지하는 메커니즘을 이해하기 위해서는, 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 하위 세포 수준에서 세포의 행동을 조사할 수있는 그들이 반응하고 환경에 적응하는 방법, 새로운 기술하는 것은 개발되었습니다. 따라서, 원자 힘 현미경 (AFM)은 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 고속 회전하는 디스크 (FSD) 공촛점 현미경과 통합되었습니다. 통합 시스템은 실시간으로 기계 자극에 세포 반응의 직접적인 광학 이미징을 허용, 모든 자기편 라이브 세포에서 분자 역동적인 연구 광범 광범위하게 적용됩니다. 굴지의 필라멘트와 초점 adhesions의 중요한 다시 정리하기는 인해 세포 체내 세포 구조로 변화를 유도하는 혀끝의 세포 표면에서 로컬 기계 자극을 표시했다. 이러한 혁신 기술은 기계적 강제에 대한 응답으로 사는 셀 구조 조정과 역학을 이해하는 새로운 정보를 제공합니다. 상세한 프로토콜과 대리인 데이터는 기계적 자극에 표시 라이브 셀 응답이 제공되는 설정합니다.
프로토콜
1. 통합 현미경 시스템의 개요
이러한 연구에 사용되는 현미경 시스템은 상세 1에서 설명되었습니다. 간단히, TIRF 첨부 (올림푸스, 센터 밸리, PA)와 거꾸로 올림푸스 IX - 81 현미경과 결합 CSU - 22 요코 스캔 헤드 (요코 전기 병원, 일본). Bioscope SZ 원자 힘 현미경 (Veeco 인스 트루먼 트의 병원, 산타 바바라, CA)는 광학 거꾸로 현미경 위에 탑재하고, 전체 시스템은 연구 등급 광학 테이블의 상단 (뉴 포트, 어빈, CA)에 위치합니다.
회전 디스크 스캐너, 외부 필터 휠과 EMCCD 카메라 (로퍼 과학 - Photometrics, 투싼, AZ)에서 구성된 공촛점 어셈블리가 rigidly 진동 감쇠에 필요한 실리콘 패드에 위치 알루미늄베이스 플레이트와 연결됩니다. 공촛점 스캐너 AFM 측정하는 동안 현미경에서 decoupled 수 treaded 칼라와 플랜지를 통해 현미경으로 연결하는 회전 디스크 스캐너로부터 진동 AFM 측정에 영향을 미치지 않습니다 그러한. 아르곤 - 크립톤 레이저 (스펙트럼 물리학, Mountain View, CA)를 각각 TIRF 및 공촛점 이미징 모드 모두 여기 소스로 사용하고 TIRF 첨부 파일 또는 ....
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토론
Cytoskeleton 70-10과 초점 adhesions가 11-16, 조립 분산 및 세포가 마이 그 레이션 또는 기계적 강제로 17 답변으로 넘겨 역동적인 구조입니다. 그들은 세포 성장, 생존, 그리고 유전자 발현을 조절에 중요한 기능을합니다. 그들의 구체적인 유통 및 역학을 아는 것은 세포가 모체와 자신 사이의 의사 소통 방법에 대한 이해를 제공합니다.
이 새로운 현미경 시스템은 자기편 살 세포의 분자 역동적인 연구 광범 광범위하게 적용됩니다. 통합 현미경은 빠른 하위 세포 변화의 양적 모니터링을 가능하게하고 기계적인 강제에 대한 응답으로 세포 리모델링의 기본 과정을 이해하기위한 중요한 새로운 도구를 제공합니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
플라스미드 Vinculin - GFP는 마이클 데이비슨, 플로리다 주립 대학, 탤러해시, 플로리다의 선물 케네스 야마다, 플라스미드 국립 보건 연구소, 치과와 Craniofacial 연구의 국립 연구소, 베데스다, 메릴랜드, 그리고 굴지 - mRFP에서 선물했다.
이 작품은 NSF 경력 보너스 # 0747334 및 AHA - 국립 SDG # 0835205N Andreea Trache에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AFM 팁 | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron 보로실리케이트 비드, 0.01N/m, 비오틴 표면 | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | DPBS 내 1mg/mL |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| 평활근 세포용 Amaxa transfection kit | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek 유리 바닥 디쉬 | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | 유리 바닥 커버슬립 no. 1.5가 포함된 멸균 60mm Falcon 디쉬 |
참고문헌
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Tay....
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재인쇄 및 허가
