RhoC GTPase 활성화 분석

요약

이 프로토콜은 세포 내에서 활성 RhoC GTPase의 수준을 결정하기 위해 분석 아래로 끌어을 활용합니다.

초록

RhoC GTPase RhoA GTPase가에 91%의 상동 있습니다. 때문에 세포에 그 유행의 RhoA GTPase 많은 시약 및 기술이 개발되었습니다. 그러나, RhoC GTPase는 상대적으로 낮은 수준에서 전이성 암세포에 표시됩니다. 따라서, 몇 가지 RhoC 특정 시약이 개발되었습니다. 우리는 RhoC GTPase를 감지 Rho 활성화 분석을 적응있다. 이 기술은 활성 RhoC의 GTPase를 빼내 GST - Rho 바인딩 도메인 융합 단백질을 활용합니다. 또한, 우리는 전체의 수준 (GTP와 GDP 바운드) RhoC의 GTPase을 결정하기 위해 분석의 시작 부분에서 총 단백질을 수확 수 있습니다. 이것은 세포에 적극적으로 대 총 RhoC GTPase의 결정을 허용합니다. 이 절차의 여러 상업적인 버전은 그러나 개발되었습니다, 상업 키트 RhoA GTPase에 최적화되어 있으며, 일반적으로 RhoC GTPase를 위해 잘 작동하지 않습니다. 분석의 부품은 RhoC 특정 항체의 개발뿐만 아니라 수정되었습니다.

프로토콜

1. 준비 GST - 융합 단백질

1. BamH1/EcoR1 pGEX3x 벡터로 subcloned rhotekin Rho 구속력을 도메인 (RBD)의 첫 번째 N - 터미널 90 아미노산을 포함하는 JM109 관할 세균의 글리세롤 주식이 만들어집니다.
   
   고효율을 보장하기 위해 다음 단계는 각 실험에 대해 수행되어야합니다. 우리의 경험에서 갓 GST - RBD는 강력하고 정확한 GTPase 활성화 분석의 열쇠입니다 준비.
2. LB의 A 50 ML에 글리세롤 주식의 (대략, 해동하지 않음) 50 μL 추가 잡고 37 ° C 하룻밤 성장.
3. 500 ML LB - A에 1시 10분을 희석 1 H.위한 성장
4. 2 시간에 대한 IPTG 0.1 밀리미터와 GST 단백질 생산을 유도.
5. 5000에서 원심 분리기 병 및 원심 분리기, Sorval GSA3 로터에 균일하게 배포 RPM 4 ° C 20 분.
6. 원심 분리기 병에 Resuspend 펠렛, 용해 완충액 10 ML *.
   * 박테리아 용해 완충액 : 20 % 자당, 10 % 글리세롤, 50 MM 트리스 산도 8.0, 0.2 MM ₂ S ₂ O _5, 2 MM MgCl _2,....

토론

절차의 가장 중요한 단계는 신선한 GST - RBD의 생성이다. 이 단계에주의하지 않으면 실패에 대한 주요 이유입니다. GST - RBD (1.2)의 세대에서 세포 lysate (2.5)와 함께 밤새 배양하기위한 모든 단계는, 하루에 수행되어야합니다. 또 다른 중요한 단계는 세포 lysates을 생산하기에 충분한 세포가있다는 것을 확실하게하는 것입니다. 세포의 낮은 수준에 존재하는 경향이 RhoC GTPase에서 볼 때 이것은 특히 중요하다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Gluthione-sepharose 4B 비드	GE Healthcare	17-0756-01
Criterion 4-20% Tris-HCl 겔	Bio-Rad	345-0032