세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델 수 체외에서 compliances 변화의 polyacrylamide의 hydrogels을 사용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
조직 강성은 세포 기능의 중요한 결정자이며, 조직 강성의 변화는 일반적으로 섬유증, 암 및 심장 혈관 질환 1-11와 관련된 있습니다. 세포 기능을 공부하기 위해 전통적인 세포 생물 학적 접근은 탄성 ECM 또는 조직 사이의 ECM의 강성의 변화의 영향에 대해 설명할 수없는 단단한 하층에 culturing 세포를 (플라스틱 요리 또는 유리 coverslips) 포함. 체외에서 생체내 조직 준수 조건 모델에, 우리와 다른 ECM - 코팅 hydrogels을 사용합니다. 우리 연구실에서 hydrogels는 생물학 12 본 조직 compliances의 범위를 모방 수 polyacrylamide를 기반으로합니다. "반응"커버 전표는 3 APTMS의 또한 다음 NaOH와 인큐베이션에 의해 생성됩니다. 글루 타 알데히드는 3 APTMS와 polyacrylamide 젤을 상호 연결하는 데 사용됩니다. 아크릴 아미드 (AC), 비스 - 아크릴 아미드 (BIS - AC)과 암모늄 persulfate의 솔루션은 히드로겔의 중합에 사용됩니다. N - hydroxysuccinimide (NHS)이 히드로겔에 crosslink ECM 단백질에 AC 솔루션에 통합됩니다. 히드로겔의 중합에 따라, 겔 표면은 같은 fibronectin, vitronectin, 콜라겐 등 선택의 ECM 단백질로 코팅되어
히드로겔의 강성은 레올로지 또는 원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 결정 및 솔루션 12 AC 및 / 또는 BIS - AC의 비율을 변화하여 조정할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 하층의 강성도 레올로지 또는 AFM을 사용하여 계량 수있는 생물 학적 조직의 강성 일치될 수 있습니다. 세포 그런 다음 필요한 실험 조건에 따라 이러한 hydrogels과 교양에 씨앗을하실 수 있습니다. 분자 분석을위한 세포 및 복구의 영상은 간단합니다. 이 기사에 대한, 우리는 20,000 파스칼 <E 분들로 3000 파스칼과 치열한 substrata / 조직> 탄성 moduli (E)를 가지고 그 같은 부드러운 substrata을 정의합니다.
프로토콜
준비
- Coverslips는 autoclaved해야합니다.
- 멸균 증류수 또는 탈이온수는 솔루션을 준비하고 세탁 coverslips를 위해서 사용해야합니다.
- AC (40 % W / V) 및 BIS - AC (1 % W / V)이 솔루션은 0.2 μm의 여과 소독을하고 있습니다. 빠른 시일 내에 사용하고 살균 필터를하기 전에, 10 % 암모늄 persulfate (100μg/ml 물을 APS)를 준비합니다. APS 솔루션은 매월 바꿉니다.
- autoclaved 수없는 등 3 APTMS, 클로로포름, glutaradehyde, NHS, 그리고 SurfaSil 같은 화학 시약은 hydrogels의 준비를 위해서만 사용되는 할당 병에 보관하고 있습니다.
- 최상의 결과를 얻으려면, hydrogels는 해당 ECM 단백질과 함께 하룻밤 배양 후 며칠 이내에 이용해야합니다.
- 히드로겔의 따르는 이전 50 ML 폴리 프로필렌 팰컨 튜브 클로로포름 (10 ML은 보통 정도로 20 위로 coverslips입니다)의 10 % SurfaSil 솔루션을 준비합니다. (저희 연구실은 보통 0.5 % 글루 타 알데히드 인큐베이션 단계에서 상단 coverslips을 siliconizes). 최소한 10 분 팔콘 튜브와 ....
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토론
히드로겔 중합 과정의 중요한 요소는 세포가 아니라 ECM - 코팅 히드로겔 자체보다 유리 coverslip에 바인딩 수 있도록 공기 방울 형성을 방지하는 것입니다. 이것은 vortexing 시각도 기포가 젤에 갇혀가 없습니다 중일 후 신중하게 중합 솔루션을 pipetting하여 예방할 수 있습니다. 우리는 항상 실험에 대한 충분한 발생시키기 위해 추가 "반응"coverslips 및 hydrogels을 준비하는 것이 좋습니다.
젤은 PBS로 씻은 때마다 특별한 관심을 지불하여야한다. 흡입 프로세스가 잡아서 찢어진 수 있으므로 히드로겔 자체와 긴밀한 접촉을 피해야합니다. perturbing hydrogels없이 액체를 대기음하는 가장 안전한 방법은 suctioning 동안 접시는 힌트를주고있다.
그것은 완전히 수준 hydrogels를 얻는 열심히하고, 히드로겔 두께의 미세한 차이가 힘들보기의 필드를 통해 이.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
작업은 저희 연구실은 국립 보건원에서 기금 지원입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | -20°C에서 보관 |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | 실온 보관 |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | 실온 보관 |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | 4°C에서 보관, 매월 교체 |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | 4°C에서 보관 |
| 커버슬립 (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| 커버슬립 (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
참고문헌
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
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재인쇄 및 허가
