이 문서에서는, 우리는 장기 사용하는 간단한 방법을 제시 전 비켜 조류 배아의 문화. 이 기술은 전체 광 액세스 및 / 또는 조류 배아의 살균 운송을 필요로하는 길이 실험에 이상적입니다.
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이 논문에서
요약
초록
정상 및 기형 배아 개발을 운전 유전과 microenvironmental 요인 사이의 관계를 이해하는 것은 새로운 치료 전략을 발견하기위한 필수적입니다. 이미징 기술의 발전은 조직과 신체 계획의 성숙의 양적 조사를 활성화하지만, 나중에 무대 배아 morphogenesis 덜 분명하다. 치킨 배아 때문에 문화와 수술 조작의 용이성이 응용 프로그램에 대한 매력적인 척추 동물 모델 시스템입니다. 초기 배아는 세포 patterning과 운명을 연구 1,2을위한 완벽한 광 액세스를 가능하게 필터 종이 링에 짧은 시간 동안 교양 수 있습니다. 같은 심장 morphogenesis로 유학 고급 개발 프로세스는 전통적으로 달걀 껍질 3-5의 창문을 통해 수행하지만,이 기술은 창 크기에 따라 광학 접근을 제한하고 있습니다. 최대 초음파 6,7 통해 고해상도 이미징을 활성화 10 일까지 우리는 이전에 육각 무게 보트에서 전 비켜 문화 전체 배아를 간단한 방법을 개발했습니다. 이러한 문화는 라이브 실험에 사용할 수 이미징 도구의 유형을 제한, 운송하기 어려웠다. 우리는 여기서 비용 효율적인 휴대용 환경 챔버와 개선된 쉘 적은 문화 시스템을 제시한다. 계란은 부분적으로 살균 물로 채워진 플라스틱 컵에 circumferentially 부착된 폴리 우레탄 막 (포장을 집착)에 의해 만들어진 그물에 금이 있었다. 아래 해먹와 물의 역학 교통으로 유도 진동을 저해할 도움 동안 해먹의 원주와 깊이의 크기는 두 표면 장력을 유지하기 위해 중요했다. 물 목욕을 순환 작은 풋프린트 또한 실험 기간 동안 지속적인 온도 제어를 사용하도록 개발되었습니다. 우리는 morphogenic 결함없이 적어도 14 일 동안 이런 방식으로 문화 배아 수있는 능력을 입증 또는 여러 microsurgical 및 이미징 응용 프로그램에서이 시스템을 지연하고 사용합니다.
프로토콜
1. 전 비켜 문화 프로토콜 :
- 수정된 닭 알을 품어
- 수정된 닭고기 달걀은 13 저장할 수 있습니다 ° C를 부화하기 전에 오일을 개발을 시작하지 않고. 레드 와인 쿨러는 온도를 유지할 수 있습니다.
- 72 시간 37.5에서 지속적인 락을 함께 60 %의 일정한 습도 보육 ° C에서 부화 계란은 뭉툭한 쪽을.
- 해먹스 (그림 1A)를 준비
- 기입 어 9온스 플라스틱 컵의 따뜻한 물을 멸균. 일반 9온스 컵 8cm의 최고의 직경이 있습니다. 우리는이 정도 크기의 이곳 표시 오랫동안 문화 응용 프로그램에 가장 적합한 것으로 나타났습니다.
- 컷 약 20 cm가 랩 집착. circumferentially 주변 고무 밴드를 배치하여 컵 위에 접사. 플라스틱은 물 위에 확산되어야합니다. 밴드 주변의 과도한 플라스틱 컷. 우리는 운송 중에 노른자 분리의 결과로, 노른자의 접착력을 방지 때문에이 응용 프로그램에 가장 적합하도록 포장을 집착 발견했습니다.
- 70 % 에탄올로 침수 kimwipes (킴벌리 - 클락, 주식 회사)와 플라스틱을 닦아주십시오.
- 부화 후 72 시간 후 배양기에서 계란을 제거합니다.
- 70 % 에탄올 침수 kimwipes로 표면을 닦는하여 달걀을 소독.
- 배아의 적절한 위치 (그림 1B) 1-2 분 수평 알을 낳습. 계란 판지 상자는 가로로 누워있는 계란을 사용할 수 있습니다. 배아 1-2 분 후에 위로 회전합니다.
- 층류 후드에서 무균 해먹스에 배아를 전송합니다.
- 계란 (그림 1C)의 아래쪽에 작은 덴트가있을 때까지 날카로운 가장자리 (양동이 또는 유리 비커의 가장자리와 같은)를 사용하여 부드럽게 계란을 누릅니다. 기억, 배아는 upperside에 위치합니다.
- 자국의 반대편에 엄지손가락을 넣고 (그림 1D) 떨어져 수평 껍질을 가져옵니다.
- 배아로뿐만 아니라 알부민 해먹 (그림 1E)에 노른자를 넣습니다. 알부민은 오랫동안 문화 관행에 대한 배아에 영양을 제공뿐만 아니라 시스템을 이동하여 유도 충격을 흡수하기 위해 노른자 주위 댐퍼닝 환경을 제공합니다. 해먹 아래 물 물 순환 히터를 사용하는 경우 배가 이미징 동안 운송 도중 땅에 병렬 머물면서 더위의 지휘자 역할을합니다 수 있도록합니다.
- 전송이 제대로 수행되는 경우 배아가 이미 정상에 위치해야합니다. 그렇지 않다면, 확대해, 불임 개체 (닫힌 곡선 가위 ie. 블런트 끝)와 directionally 애무 배가 위로 회전 그러한 노른자를 사용합니다.
- 배아를 봉인하기 위해 컵 위에 10cm 직경 페트리 접시를 놓습니다.
- 37.5에서 보육 세트로 컵 문화 플레이스 ° C. 휴대용 인큐베이터를 사용하는 경우, 증류수로 가득 9월 1일부터 2일까지 오즈의 마법사 '컵을 배치하는 것은 ~에 습도를 유지 60% (그림 1 층).
- 배아 일 7.2 이상 culturing의 배아는 조각 달걀 껍질 조각은 뼈 개발과 성숙을위한 칼슘 소스로 배아의 주변에 흩어져해야하는 경우.
외부 인큐베이터 영상 / 조작을위한 액세서리 장비 :
순환 물 목욕은 배양 온도를 유지하기 위해 집안에 지어진 동안 영상이나 조작 (그림 3). 컵 맞는 물 목욕은 물을 저수지에 맞는 크기의 튜브를 통해 연결되어 있습니다. 저항 히터는 물의 온도에 따라 수동으로 규제하는 저수지에서 물을 가열. 펌프가 물을 순환. Pictoral 표현 ultrasongraphy / florescent 현미경 (그림 3)를 통해 이미징 편리 모습.
그림 1. 해먹 및 해먹스에 닭 배아의 양도의 준비.
그림 2. 대표 결과 -. 예 비켜 문화 기술을 통해 재배 여러 단계 닭 배아 HH 17 이후 태아는이 기술을 통해 성장하실 수 있습니다.
그림 3. 이상적인 개발 온도에서 배아를 유지하는 전 비켜 문화 시스템과 함께 사용하는 물 순환 시스템의 개략도 및 대표 사진.
2. 선택된 애플 리케이션 :
I.의 Microinjection
이 배아 문화는 솔루션 대비 기반 이미징 (예 형광 현미경, 마이크로 계산된 지형 등) (그림 4) vasculature에 주입해야 microinjection 응용 프로그램에 적합합니다. 아래 microinjection 프로토콜은 다음과 같습니다 :
- 주사 appara 준비내밀어
- 패션은 microforge를 사용하여 beveled 팁 microneedles에 0.75 ID 유리 모세관 튜브를 뽑아. 필요한 팁의 크기가 원하는 목표 정맥 직경 / 유동 속도에 따라 다릅니다.
- 0.03 인치 ID의 실리콘 튜브에 주사기를 연결합니다.
- 주입하는 솔루션으로 튜브를로드하고 튜브에 microneedle를 연결합니다.
- 주사기 홀더 또는 주사기 펌프에 micromanipulator과 주사기에 microneedle를 놓습니다.
- 컵에 따라서 배아를 인상 멸균 물을 추가합니다. 우리는 혈관 (예 vitelline 선박)에 바늘의 적절한 침투를 위해, 수평 침투가 필요하다고 경험. 이것은 배 (胚)가 컵의 가장자리와 같은 비행기에 있어야합니다.
- 배아에서 플라스틱을 가지고있는 고무 밴드를 꺼내.
- 부드럽게 플라스틱 한쪽을 들어 컵 일부 멸균 물을 추가합니다.
- 다시 플라스틱에 고무 밴드를 고정합니다.
- 배아 선박에 대한 해결책을 주사. 우리의 경험에서 솔루션 vitelline 용기에 주입되었을 때, 출혈을 유발하지 않고 효율적인 재관류를 유지하기 위해 혈관 직경의 크기 약 10분의 1 일 있어야만 microneedles.
- 기포가 전혀 형성을 보장하지 microneedle에 대한 해결책을 펌프.
- 선택한 그릇에 microneedle의 팁을 맞춥니다. vitelline 선박 들어, 포크 영역을 선택하면 선박에 침투 최대 영역을 제공합니다.
- 배를 향에 바늘을 밀어. 배는 먼저 철회합니다. 바늘이 침투되면, 재관류를 시작합니다. 흐르는 혈액의 색깔은 재관류로 변경해야합니다. 색상의 변화가 본적이되지 않으면 바늘이 혈관 밖으로 침투 수 있습니다. 선박의 색상 변경을 볼 때까지 동시에 솔루션을 양수하면서 그 경우에는 천천히 microneedle을 철회. 재관류가 완료되면, 선박의 microneedle을 철회.
그림 4 : 전 비켜 교양 여자는 배아의 vasculature에 형광 염료의 Microinjection.
II. Microsurgical 절차 - 왼쪽 심방세동 내고
이 전 비켜 문화 설치는 배아에 대한 모든 액세스를 제공 이후 여자는 태아에 외과 응용 프로그램을 수행하는 데 이상적입니다. 아래 예제 기술에 대한 프로토콜은, 심방 내고 (랄) (그림 5)은 떠났다. 절차는 약 24 시간 문화 시대 (HH24)로 수행됩니다 :
- 매듭을 overhand 준비 ~ 10-0 나일론 수술 봉합사를 사용하여 0.5 mm의 직경.
- 고급 집게로 로컬 배아 통해 chorionic와 allantoic 세포막을 제거하고 배아의 왼쪽 볼 것을 그것이 수직으로 같은 회전 뒷부분에서 배아를 리프트.
- 고급 집게를 사용하여 좌심방을 통해 심낭을 제거합니다.
- 좌심방을 통해 매듭을 정렬하고 조입니다. 왼쪽에 원래의 혈액 흐름 ~ 75 % 금지로 매듭 너무 묶여 있어야합니다. microscissors와 매듭의 가장자리를 잘라 조심스럽게 초과 봉합사를 제거하고 폐기.
- 원래 방향 (위에서 오른쪽)에 다시 배아를 회전합니다.
- 섐 컨트롤은 동일한 절차를 포함되지만 봉합사를 막 통과하고 묶여되지 않습니다. 효과 랄 치료 (75 % 수축)가 24시간 수술에서 확인되며, 자격이 배아는 제외됩니다.
그림 5 :. 컨트롤과 왼쪽 심방 출혈도 잡았 여자의 배아 화살표는 출혈도 잡았 배아의 75 퍼센트 작은 왼쪽 심방을 보여줍니다.
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토론
광 접속 및 조류 배아의 실험은 알 껍질의 제약으로 인해 도전이다. 윈도우 크게 분사하고 microsurgical 접근 8 액세스할 수 microvessels의 수를 제한합니다. 결과적으로 초기 단 배아는 조작과 지속적인 관찰이 불가능하실 수 있습니다. 장기 문화 9 방해 배아에서 표면 장력의 불충 분한 제어하기 때문에 배양 접시를 사용하여 초기 전 비켜 문화는 제한된 사용했다. 우리는 최근에 허용 표면 tenstion 7 유지 육각형 무게는 보트를 사용하여이 기술을 개선, 이러한 문화는 전송하기 어려웠다. 여기에 제공 기술은이 문제를 해결하고 크게 microinjection과 수술 절차를 포함하여 고용 수있는 실험 방법과 영상 기술의 종류를 확장합니다. 연구 나중에 morphogenic 이벤트를 이해에 초점을 맞추고,이 기술은 모니터링 및 현재 실험적으로 지속적인 연구 개발 불가능 이벤트의 변조를 사용합니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 가임 화이트 레그혼(white Leghorn) 닭 알 | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| 사란 랩(Saran Wrap) | |||
| 킴와이프스(Kimwipes) | Kimberly-Clark Corporation | ||
| 고무줄 | |||
| 따뜻한 멸균수 | |||
| 9 oz 플라스틱 컵 | |||
| 직경 100 mm 페트리 접시 | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| 플루오레세인 결합 덱스트란 (2 MDa, phosphate buffered saline 내 1% w/v) | Sigma-Aldrich | ||
| 마이크로포지(Microforge) | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| 유리 모세관 (내경 0.75 mm) | |||
| 마이크로매니퓰레이터(Micromanipulator) | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| 형광 현미경 | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| 미세 55-포셉(Fine 55-forceps) | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 나일론 외과용 봉합사 | Ethicon Inc. | ||
| 튜브 | VWR international | 외경 1mm | |
| 3 mL 주사기 | BD Biosciences | ||
| 200 μL 피펫 및 피펫 팁 | VWR international |
참고문헌
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
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- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
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