이 문서에서는, 우리는 장기 사용하는 간단한 방법을 제시 전 비켜 조류 배아의 문화. 이 기술은 전체 광 액세스 및 / 또는 조류 배아의 살균 운송을 필요로하는 길이 실험에 이상적입니다.
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이 논문에서
요약
초록
정상 및 기형 배아 개발을 운전 유전과 microenvironmental 요인 사이의 관계를 이해하는 것은 새로운 치료 전략을 발견하기위한 필수적입니다. 이미징 기술의 발전은 조직과 신체 계획의 성숙의 양적 조사를 활성화하지만, 나중에 무대 배아 morphogenesis 덜 분명하다. 치킨 배아 때문에 문화와 수술 조작의 용이성이 응용 프로그램에 대한 매력적인 척추 동물 모델 시스템입니다. 초기 배아는 세포 patterning과 운명을 연구 1,2을위한 완벽한 광 액세스를 가능하게 필터 종이 링에 짧은 시간 동안 교양 수 있습니다. 같은 심장 morphogenesis로 유학 고급 개발 프로세스는 전통적으로 달걀 껍질 3-5의 창문을 통해 수행하지만,이 기술은 창 크기에 따라 광학 접근을 제한하고 있습니다. 최대 초음파 6,7 통해 고해상도 이미징을 활성화 10 일까지 우리는 이전에 육각 무게 보트에서 전 비켜 문화 전체 배아를 간단한 방법을 개발했습니다. 이러한 문화는 라이브 실험에 사용할 수 이미징 도구의 유형을 제한, 운송하기 어려웠다. 우리는 여기서 비용 효율적인 휴대용 환경 챔버와 개선된 쉘 적은 문화 시스템을 제시한다. 계란은 부분적으로 살균 물로 채워진 플라스틱 컵에 circumferentially 부착된 폴리 우레탄 막 (포장을 집착)에 의해 만들어진 그물에 금이 있었다. 아래 해먹와 물의 역학 교통으로 유도 진동을 저해할 도움 동안 해먹의 원주와 깊이의 크기는 두 표면 장력을 유지하기 위해 중요했다. 물 목욕을 순환 작은 풋프린트 또한 실험 기간 동안 지속적인 온도 제어를 사용하도록 개발되었습니다. 우리는 morphogenic 결함없이 적어도 14 일 동안 이런 방식으로 문화 배아 수있는 능력을 입증 또는 여러 microsurgical 및 이미징 응용 프로그램에서이 시스템을 지연하고 사용합니다.
프로토콜
1. 전 비켜 문화 프로토콜 :
- 수정된 닭 알을 품어
- 수정된 닭고기 달걀은 13 저장할 수 있습니다 ° C를 부화하기 전에 오일을 개발을 시작하지 않고. 레드 와인 쿨러는 온도를 유지할 수 있습니다.
- 72 시간 37.5에서 지속적인 락을 함께 60 %의 일정한 습도 보육 ° C에서 부화 계란은 뭉툭한 쪽을.
- 해먹스 (그림 1A)를 준비
- 기입 어 9온스 플라스틱 컵의 따뜻한 물을 멸균. 일반 9온스 컵 8cm의 최고의 직경이 있습니다. 우리는이 정도 크기의 이곳 표시 오랫동안 문화 응용 프로그램에 가장 적합한 것으로 나타났습니다.
- 컷 약 20 cm가 랩 집착. circumferentially 주변 고무 밴드를 배치하여 컵 위에 접사. 플라스틱은 물 위에 확산되어야합니다. 밴드 주변의 과도한 플라스틱 컷. 우리는 운송 중에 노른자 분리의 결과로, 노른자의 접착력을 방지 때문에이 응용 프로그램에 가장 적합하도록 포장을 집착 발견했습니다.
- 70 % 에탄올로 침수 kimwipes (킴벌리 - 클락, 주식 회사)와 플라스틱을 닦아주십시오.
- 부화 후 72 시간....
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토론
광 접속 및 조류 배아의 실험은 알 껍질의 제약으로 인해 도전이다. 윈도우 크게 분사하고 microsurgical 접근 8 액세스할 수 microvessels의 수를 제한합니다. 결과적으로 초기 단 배아는 조작과 지속적인 관찰이 불가능하실 수 있습니다. 장기 문화 9 방해 배아에서 표면 장력의 불충 분한 제어하기 때문에 배양 접시를 사용하여 초기 전 비켜 문화는 제한된 사용했다. 우리는 최근에 허용 표면 tenstion 7 유지 육각형 무게는 보트를 사용하여이 기술을 개선, 이러한 문화는 전송하기 어려웠다. 여기에 제공 기술은이 문제를 해결하고 크게 microinjection과 수술 절차를 포함하여 고용 수있는 실험 방법과 영상 기술의 종류를 확장합니다. 연구 나중에 morphogenic 이벤트를 이해에 초점을 맞추고,이 기술은 모니터링 및 현재 실험적으로 지속적인 연구 개발 불가능 이벤트의 변조를 사용합니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 가임 화이트 레그혼(white Leghorn) 닭 알 | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| 사란 랩(Saran Wrap) | |||
| 킴와이프스(Kimwipes) | Kimberly-Clark Corporation | ||
| 고무줄 | |||
| 따뜻한 멸균수 | |||
| 9 oz 플라스틱 컵 | |||
| 직경 100 mm 페트리 접시 | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| 플루오레세인 결합 덱스트란 (2 MDa, phosphate buffered saline 내 1% w/v) | Sigma-Aldrich | ||
| 마이크로포지(Microforge) | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| 유리 모세관 (내경 0.75 mm) | |||
| 마이크로매니퓰레이터(Micromanipulator) | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| 형광 현미경 | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| 미세 55-포셉(Fine 55-forceps) | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 나일론 외과용 봉합사 | Ethicon Inc. | ||
| 튜브 | VWR international | 외경 1mm | |
| 3 mL 주사기 | BD Biosciences | ||
| 200 μL 피펫 및 피펫 팁 | VWR international |
참고문헌
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E.
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재인쇄 및 허가
