방법 논문

판막병 내피 세포의 분리

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DOI:

10.3791/2158

⸱

2010년 12월 29일

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Cornell University

이 논문에서

요약

우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.

초록

심장 판막은 심장 혈관 시스템을 통해 단방향 혈액 흐름을 유지하는 책임은 전적으로 귀하에게 있습니다. 이 얇고 섬유질 조직들은 수명 동안 억 여러 번 열고 닫는 등 상당한 기계적 스트레스를 받게됩니다. 이러한 조직의 놀라운 인내력은 내피 거주 판막병 (VEC)와 중간 세포에 의한 (VIC)는 지속적으로 지방 기계 및 생물 학적 신호에 대한 응답으로 수리 및 개조. 최근 우리는 시험 관내 실험에서 중요한 역할을 담당해 왔습니다있는 이들 세포의 독특한 행동을 이해하기 시작했다. 특히 도전은 VEC의 격리와 문화입니다. 특별한주의는 순간부터 조직이 최종 도금을 통해 호스트에서 제거됩니다 사용해야합니다. 여기 우리는 직접적인 고립, 측면 구체적인 고립, 문화, VEC의 순수한 인구의 검증을위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 표면 세포를 이동시키다하는 부드러운 면봉 사장을 때릴 때의 기술 다음 효소 소화를 사용합니다. 이러한 세포는 다음 튜브에 수집하여 펠렛으로 centrifuged 있습니다. 펠렛은 다음 resuspended과 콜라겐 I 매트릭스 사전 코팅 문화 flasks로 도금입니다. VEC의 표현형가 접촉에 의해 확인하는 것은 성장과 같은 PECAM1 (CD31)로 내피 특정 마커의 표현을 저해, 폰 Willebrand 팩터 (vWF), 그리고 알파 - 부드러운 근육 굴지 (α - SMA)의 부정적인 표현. VEC의 기능적 특성은 acetylated LDL 높은 수준의와 관련된 있습니다. 혈관 내피 세포와는 달리, VEC는 일반적으로 배아 밸브 형성 한 동안 발생 mesenchyme로 변환하는 독특한 능력을했습니다. 이것은 또한 체외 문화에 크게 연장 게시물 합류하는 동안 발생할 수 있으므로주의가 합류 또는 가까운 통로로하여야한다. VEC 분리 후, VIC의 순수한 인구 그때 쉽게 취득하실 수 있습니다.

프로토콜

1. 준비

  1. 대상 기기에 압력솥은 다음 항목을 트레이 :
    1. 톱니 모양의 조직 포셉 - 전단지 조직을 처리
    2. 조직 가위 (8cm) - 전단지 조직 및 cusps을 트리밍을 위해
    3. 면화 면봉 - 전단지 또는 끝에서 내피 레이어를 격리 시킨것에 대한
  2. 무균 collagenase 솔루션을 확인하십시오
    1. 18 MΩ 물 250 ML에 가루 DMEM의 4.0 g을 추가합니다.
    2. 나트륨 중탄산염의 1.11 g을 추가합니다.
    3. (600 U / ML) collagenase의 180,000 단위를 추가합니다.
    4. 1퍼센트 (3mL) 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다.
    5. 7.2 솔루션의 산도를 조정합니다.
    6. 270 ML에 대한 해결책을 가져 오십시오.
    7. 0.2 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 소독.
    8. 무균 태아 소 혈청의 10 % (30mL) 추가합니다.
  3. 무균 내피 세포 미디어 만들기
    1. 18 MΩ 물 400 ML에 가루 DMEM의 6.7 g을 추가합니다.
    2. 나트륨 중탄산염의 1.85 g을 추가합니다.
    3. ....

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토론

밸브 모양의 생물학의 이해는 분리 기술적인 문제 및 밸브 모양의 내피 세포의 culturing 순수 인구에 의해 장애인되었습니다. 일반 절연 기술 기본 기초 매트릭스 또는 내피 접착 채권 2,3의 화학 분해 효소의 소화를 포함. 예비 분리 실험은 질적으로 분리 직원과 부화 기간 변화에 의해 평가되었다. 이러한 실험의 결과는 최대 60 분 동안 그 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (또는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 부화가 dislodging 세포에 실패했습니다했다. 그러나, 50~10분위한 collagense의 소화는 순수한 밸브 모양의 내피 세포 (표 1)의 사용 가능한 번호를 검색하는 효과 입증. 기타 효소 솔루션은 이러한 dispase, 특히 기본 매트릭스 4의 주요 구성 요소입니다 콜라겐 유형 IV 및 fibronectin를 대상으로 수있는 metalloprotease과 보완으로 제안되었습니다. 해방 세포는 같은 clonal 확장이나 자기 선택 .......

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 연구는 NSF 경력 수상, 하트웰 재단, 그리고 미국 심장 협회 (# 0830384N)에 의해 지원됩니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco’s Modified Eagle MediumMediatech, Inc.50-103-PB
소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)GIBCO, by Life Technologies26140
페니실린-스트렙토마이신(Penicillin Streptomycin)GIBCO, by Life Technologies15140-122
0.25% Trypsin-EDTAGIBCO, by Life Technologies25200
헤파린 나트륨염(Heparin Sodium Salt)Sigma-AldrichH4784-1G
콜라게나제 Type 2(Collagenase Type 2)Worthington BiochemicalLS004176
DPBSGIBCO, by Life Technologies21300-058
쥐 꼬리 콜라겐(Rat Tail Collagen)BD Biosciences354236
멸균 면봉(Critical Swabs)VWR international89031-270
탄산수소나트륨(Sodium Bicarbonate)Sigma-Aldrich55761
T25 플라스크BD Biosciences353018
T75 플라스크BD Biosciences353136
24웰 플레이트Falcon BD353047
60x15 mm 디쉬VWR international25384-092
60x15 유리 디쉬VWR international89000-310
파라핀 매몰 왁스(Paraffin Embedding Wax)Electron Microscopy Sciences19304-01
정밀 글라이드 바늘(Precision Glide Needles)BD Biosciences305165
500 mL Nalgene 필터VWR international73520-985
1L Nalgene 필터VWR international73520-986
조직 포셉(Tissue Forceps)Fine Science Tools11023-15
FSC 핀셋 #5Fine Science Tools11295-00

참고문헌

  1. Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
  2. Johnson, C. M., Fass, D. N.

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재인쇄 및 허가

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태그

IPECAM1 CD31

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