사용 Schwann - astrocyte 상호 작용 분석 체외에서 Assays

요약

이 문서는 stepwise 방식으로 표현하고자하는 일반적으로 사용되는 체외에서 assays.

초록

Schwann 세포는 척수 부상 다음과 복구 전략에서 일반적으로 사용되는 셀 중 하나입니다. Schwann 세포가 axonal 재생을 지원하고 secreting 성장 요인의 ^1,2로 돋아 및 유착 분자 ³ 세포외 기질 분자 ⁴ 증진 성장을 제공할 수 있습니다. 또한 그들은 부상 ⁵ 사이트에 demyelinated axons를 myelinate.

그렇지만 이식 이어 Schwann 전지 보형물 사이트에서 이주 없어하고 호스트 astrocytes ^6,7로 뒤섞다 없어. Schwann 세포와 astrocytes 사이에 날카로운 경계의 형성이 결과, proximally 및 distally 호스트 조직에 그래프트 다시를 종료하려고 성장 axons에 대한 장애물을 만드는. Schwann 세포와 접촉 Astrocytes도 비대를 받아야하고 억제 분자 ^8-13을 - 규제.

시험 관내 assays에서 모델 Schwann 세포 astrocyte 상호 작용하는 데 사용되었습니다과 세포 동작을 기본 메커니즘을 이해하는 것이 중요했습니다.

시험 관내 assays에서 이들은 공동 문화 두 가지 세포를 분리 전선에만 작은 격차로 다른 지역을 점유 각 세포 유형으로 두 개의 다른 세포를 사용하여 만든 경계 분석을 포함합니다. 세포 분열 및 마이 그 레이션으로 두 세포 면에서 서로 가까이 그리고 마지막으로 충돌하십시오. 이것은 경계에서 분석하는 두 세포 인구의 동작을 수 있습니다. 같은 기술의 또 다른 변화는 문화의 두 세포 인구를 섞어하고 시간이 지남에 따라 두 세포 유형은 Schwann 세포와 분리 함께 여러 Schwann - astrocyte 경계를 만드는 astrocytes 사이에 섬이 함께 clumped하는 것입니다.

두 세포 유형의 상호 작용을 연구에 사용되는 두 번째 분석은 세포의 움직임이 다른 세포 유형 monolayer ^14,15의 표면에 추적할 수있는 마이 그 레이션 분석이다. 이 분석은 일반적으로 바뀌 coverslip 분석으로 알려져 있습니다. Schwann 세포는 작은 유리 파편에 교양하고 그들은 astrocyte monolayers의 표면에 얼굴을 거꾸로하고 마이 그 레이션이 coverslip의 가장자리에서 평가됩니다.

두 assays은 세포 배제와 경계 형성에 관련된 기본 메커니즘을 연구의 수단이되었습니다. 분자의 일부는 이러한 기술이 N - Cadherins 15, 콘드로이틴 황산염의 proteoglycans (CSPGs) ^16,17, FGF / 헤파린 ¹⁸ 에프 / Ephrins ¹⁹ 등이 사용 확인.

이 문서는 stepwise 방식으로 경계 분석 및 마이 그 레이션 분석을 설명하고 발생할 수있는 가능한 기술적인 문제를 명료하게하다 예정입니다.

프로토콜

1. 경계 분석 :

1. 기본 준비 : 상공 회의소 슬라이드는 폴리 - D - 라이신 야간 및 멸균 유리 슬라이드로 코팅 아르는 실험을 시작하기 전에 준비가되어 있습니다. 매체는 Dulbecco의 수정된 이글의 10% 소태아 혈청 (FCS)와 보충 중간 (DMEM),, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 - Fungizon (PSF)를 사용하여 준비가되어 있습니다. 또한 칼슘 / 마그네슘 무료 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)의 병이 준비됩니다.
2. 플라스크에 교양 기본 쥐 Schwann 세포는 0.1 % 트립신을 사용하여 3 분 trypsinized 있습니다. 기본 쥐 astrocyte 문화는 0.1 % 트립신을 사용하여 5 분 trypsinized입니다.
   트립신은 DMEM를 추가하면 10% FCS, 1 % PSF로 보충하여 inactived 있습니다.
3. Trypsinized Schwann 세포와 astrocytes 15 ML 팰컨 튜브를 별도로 전송하고 5 분 300G에 centrifuged 있습니다.
4. Schwann 세포와 astrocytes은 (세포 밀도의 변화에 대한 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오) 2 × 10 ⁶ 밀도에 다시 중지합니다.
5. Schwann 세포 현탁액의 50 μL 방울 PDL 코팅 챔버 슬라이드 우물 중 한 끝에 배치됩니다. 유리 스트립은 바로 가장자리를 생성하기 위해 챔버의 중심으로 얼룩 드롭을하는 데 사용되었다. (유리 커터를 사용하여 직사각형 유리 coverslips 그것은 경계 assays 사용 챔버 슬라이드의 너비에 맞게 것이 길이 방향 있도록 절단됩니다)
6. astrocyte 정지 50 μL의 두 번째 드롭 같은 우물의 반대 끝에 위치하고 사이에 작은 0.2mm 간격으로 첫 번째 드롭의 얼룩에 평행 직선 모서리를 만드는 중심으로 발랐습니다.
7. 챔버는 방울이 37 인큐베이터에 배치됩니다 ° C를 2 시간 포함하는 슬라이드.
8. 2 시간 후에, 문화가 아닌 연결된 세포 파편과 DMEM / 10 % PSF가 추가 FCS / 1 %를 포함하는 새로운 매체를 제거하는 DMEM로 씻어되었습니다.
   참고 : DMEM / 10 % FCS / PSF가 forskolin (2μM)와 보빈 뇌하수체 추출 (BPE) (10μg / ML) Schwann 세포의 증식을 자극과 보충 수 있습니다 1퍼센트. BPE는 장기 Schwann 세포 배양을 허용하는 데 필요한 성장 요인을 공급하고 forskolin은 확산을 유도하기 위해 Schwann 세포 내에서 순환 아데노신 monophosphate 수준을 올립니다
9. 전지는 37 ° C, 7퍼센트 CO ₂ 배양기에서 약 8-10일에 대한 양식입니다. 매체는 3 일마다 변경해야합니다. 두 셀 전선 결국 서로 연락하고 날카로운 경계는 두 세포 유형 간의 형태 것입니다. 이 단계에서 실험 경계 형성에 관련된 요인을 분석 수행하실 수 있습니다.
10. 공동 문화 4 % 포름 알데히드와 Schwann 세포가 공동 문화의 세포를 식별하는 안티 GFAP 항체와 백신 항체 P75과 astrocytes와 immunostained 수를 사용하여 해결할 수 있습니다. P75 항체는 astrocytes가 부족 Schwann 세포에 낮은 친화 NGF 수용체를 인식합니다. 안티 GFAP 항체는 세포질에 astrocyte glial localizes firbrillary 산성 단백질을 인식합니다. (대표 경계에 대한 그림 1A 참조)

2. 마이 그 레이션 분석 :

1. 네 잘 접시 (15mm 우물)는 PDL 아르 코팅 숙박과 astrocyte monolayers을 만들기위한 준비.
2. 기본 astrocyte 문화 0.1 % 트립신을 사용하여 5 분 trypsinized입니다. 트립신은 DMEM 10 % FCS, 1 % PSF 5 분 300G에서 centrifuged 세포와 보충 추가 inactivated입니다. (그림 2 참조)
3. Astrocytes는 1x10 ⁵ 셀 / ML에서 다시 중지됩니다. 이 솔루션 1 ML 4 잘 접시에 잘 각 PDL 코팅에 추가됩니다. monolayer가 완전히 합류 때까지 Astrocytes는 24~48시간에 대한 양식입니다.
4. 병렬 astrocyte monolayers, 원형 PDL - 코팅 유리 coverslips가 50 ML 튜브에 배치와 유리의 작은 조각을 만드는 플라스틱 피펫을 사용하여 조각된다 만드는, astrocyte monolayers에서 Schwann 세포의 마이 그 레이션을 평가합니다.
5. 유리 조각은 6 웰 플레이트 접시에 잘으로 전송되며 크기의 조각 적합한 집게를 사용하면 선택 및 기타 우물에 배치됩니다. 5 유리 조각은 6 잘 접시 각 우물에 배치됩니다.
6. 플라스크에 교양 기본 Schwann 세포는 0.1 % 트립신을 사용하여 3 분 trypsinized 있습니다. Trypsinized Schwann 세포 15 ML 팔콘 튜브를 분리 전송 5 분 300 G에서 centrifuged 있습니다. Schwann 세포가 DMEM/10 % FCS / 1퍼센트 PSF에서 배 10 ⁶ 세포 / ML 다시 중지됩니다.
7. Schwann 세포 현탁액 20 μL 방울는 6 잘 접시와 세포에 배치 각 1 부 5 coverslip 조각 37 2 시간 ° C, 7 % CO _2에서 incubated 아르 이상 추가됩니다.
8. 2 시간 후에, Schwann 세포는 coverslip 조각에 붙어 있으며 DMEM/10 %가 FCS / 1% PSF는 (forskolin과 10μg / BPE의 ML의 2μM과 보충 조각이 완전히 중간 덮여되도록 각 잘 추가됩니다) .
9. 유리 조각이 완전히 죄수 때까지 조각을 포함하는 6 자 플레이트는 다음 24-48시간위한 인큐베이터에 배치됩니다Schwann 세포와 함께 유창.
10. 일단 조각이 Schwann 세포와 합류 있으며, 각 조각은 신중하게 날카로운 집게를 사용하여 포착하고 astrocyte monolayer에 거꾸로 땅에 얼굴 그리고 무소속의 세포를 제거하고 HBSS에 담근이다.
11. 각 자 그러면 FCS / 1% PSF와 Schwann 세포가 24-48 기간 동안 마이 그 레이션하는 허용하는 DMEM/10 % 1 ML으로 덮여있다. 이 기간 동안 이러한 성장 요인 실험 시약은 Schwann 세포의 마이 그 레이션의 수와 거리에 그들의 효과를 평가하기 위해 추가할 수 있습니다.
12. 마이 그 레이션 기간에 따라, 유리 파편은 30 분 4 % paraformaldehyde (PFA)를 추가하여 각 우물의 바닥에 고정하고 있습니다. 다음 고정은 p75에 대한 Schwann 세포 (낮은 친화 NGF 수용체를 인식) 다음 ABC strepavidin 키트 - diaminobenzidine (DAB)를 사용하여 얼룩 빛 현미경 Schwann 세포의 시각화를 허용하려면 immunostain.

3. 대표 결과 :

80-10일 다음 Schwann - astrocyte 공동 문화는 두 세포 유형 간의 날카로운 경계를 표시합니다. Schwann 세포의 증식이 향상으로 forskolin과 BPE는 문화에 사용되는 경우에는이 경계가 더 발음됩니다.

아무런 경계가 10 일 기간 동안 관찰되지 않은 경우 경계가 설립되기 전까지는, 문화의 시간은 더욱 증가 수 있습니다. 세포 밀도의 비율을 변경하면 경계 형성을 증가하는 대안적인 방법입니다. 3시 1분 Schwann의 비율 : 셀 suspensions ^8,18를 준비할 때 astrocyte 세포 밀도를 사용할 수 있습니다.

경계가 설립 어디에 선을 그림이 그려진 수 있으며 astrocyte 지역으로 마이 그 레이션 Schwann 세포의 개수가 형광 현미경으로 계산 수 있습니다 intermingling 세포를 평가하기 위해, Schwann 세포와 astrocytes를 식별하는 immunostaining에 따라.

아래 이미지의 두 예제 획득 경계, Schwann 세포와 astrocytes (그림 1A)와 세포가 가난한 기술 (그림 1B)로 인해 다른 지역으로 잘 차별하지 않은 하나의 잘 구성된 인종 차별과 하나가 있습니다.

. 그림 1 바운더리 분석 : Schwann - astrocyte 상호 작용. Schwann 세포의 증식을 자극하는 forskolin과 BPE의 면전에서) 십일 공동 문화 분석은 두 가지 세포 유형 (적색 = P75, 녹색 = GFAP) 사이에 날카로운 경계를 보여줍니다. B) 경계가 형성되지 십일 공동 문화 분석과 두 세포 전선이 혼합. (빨간색 = P75, 녹색 = GFAP)의 경계를 준비​​하는 동안 서로 옆에 astrocyte와 Schwann 세포 방울을 배치하면서이 두 방울의 혼합으로 인해되었습니다.

그림 2. 합류 astrocyte monolayer 대표 이미지

마이 그 레이션 assays는 다른 세포 유형의 표면 위에 한 셀 유형의 움직임을 평가하고 따라서 경계 형성의에서 다른 현상을 평가합니다.

연습이 monolayers에 반전 coverslips을 보장하기 위해 필요한 것은 Schwann 세포 덮인 날카로운 집게로 유리 파편과 astrocyte monolayers 있습니다. 손상으로 이어질하지 않습니다 Schwann 세포, 마이 그 레이션의 최대 거리 coverslip의 가장자리에서 마이 그 레이션하는 세포의 수를 마이 그 레이션을 평가하는 것은 가벼운 현미경으로 측정할 수 있습니다.

아래 astrocyte monolayer의 표면 (그림 3)에서 DAB의 얼룩을 사용하여 P75 항체와 스테인드 Schwann 세포의 이미지입니다.

거꾸로 coverslip 분석을 사용하여 그림 3. 마이 그 레이션 분석. A) Schwann 세포는 (갈색, p75 항체와 immunostained) coverslip의 가장자리에서 떨어져 마이 그 레이션. 멀리 coverslip에서 셀 마이 그 레이션의 방향 화살표를 가리 킵니다.

토론

위에서 설명한 assays은 Schwann - astrocytes 및 astrocytic 환경에서 제한된 Schwann 세포 마이 그 레이션 사이의 경계 형성에 관련된 여러 요인의 역할을 보여주는 여러 연구에 사용되었습니다.

그것이 전략의 개발 최적화하도록하고 이식 다음 Schwann 세포 이식의 통합을 강화하고 이렇게에서 허용 호스트 조직에 그래프트 뒷부분에서 재생의 axons의 출구를 촉진하는 것처럼 이러한 이벤트를 기본 메커니즘을 이해하는 것은 필수적입니다 연결의 형성 호스트 조직과 함께.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM	Invitrogen	41966-029
HBSS	Invitrogen	14170-088
FCS	Invitrogen	10091-148
PSF	Invitrogen	15240-062
BPE	Invitrogen	13028-014
Forskolin	Calbiochem	344273
커버글라스	VWR international	631-0149
커버글라스(직사각형)	Menzel-Glaser	BB022050A1
챔버 슬라이드	Nalge Nunc international	177380
4 웰 플레이트, 6 웰 플레이트	Nalge Nunc international		4 웰 플레이트6 웰 플레이트
rat p75 항체	EMD Millipore	MAB365
GFAP 항체	Dako	Z0334
2차 항체 (Alexa 접합)	Invitrogen	A-11004 A-11034	Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488
2차 비오틴화 항체	Vector Laboratories		Goat anti mouse
DAB 정제	Sigma-Aldrich	D4418
ABC elite 키트	Vector Laboratories	PK-6100
정밀 핀셋	Fine Science Tools	11295-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6168
Fluorosave	Calbiochem	345789