Method Article

에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

DOI:

10.3791/2220

⸱

December 21st, 2010

 ,  , 
1Department of Biology, Portland State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.

Abstract

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DNA 손상의 존재에 정확 복제는 모든 세포 유형에서 관찰 널리 바로 인간 암의 개발과 관련된 것으로 세포 rearrangements 및 돌연변이 유발의 대부분을 담당하고 있습니다. 이러한 UV 방사선에 의해 유도되는 등 DNA의 손상, 심한 정확하게 게놈 템플릿을 복제 복제의 능력을 impairs. 유전자 제품의 숫자는 복제 템플릿에 DNA의 병변 생기면 필요한 것을 발견되었습니다. 그러나, 남은 과제는 복제하는 동안 어떻게 이러한 단백질 프로세스 병변을 확인할 수있다

Protocol

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1. 성장과 자외선 조사.

  1. 0.4 % 포도당, 0.2 % casamino의 지방산 및 10 μg / ML의 thymine (DGCthy 매체) 및 100 μg / ML 암피실린와 보충 데이비스 중간 1 자란 플라스미드 pBR322를 포함하는 새로운 숙박 문화의 200μl가 pelleted입니다. 세포 펠렛은 다음 암피실린을 부족한 200μl DGCthy 매체에 resuspended 및 DGCthy 매체 20 ML을 예방하는 데 사용됩니다.
  2. 문화는 0.5의 OD 600 (~ 5 X 10 8 셀 / ML)를 37 떨고 인큐베이터에서 암피실린 선택 ° C 않고 재배하고 있습니다. 암피실린없는 성장은 어떤 돌연변이에서 발생할 수 비정상적인 또는 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택을 방지합니다. 손상을 유발하는 자외선을 사용하는 경우는 자외선의 효과적인 복용량을 줄이고, 이러한 파장과 보호막 세포에서 강하게 흡수하기 때문에 또한, 미디어에서 암피실린의 제거가 필요합니다.
  3. 노란 불빛 아래에서 일하는 문화가 교반을위한 회전 플랫폼에서 15cm 직경 페트리 접시에 배치됩니다. 우리의 문화는 UVC 광도계를 사용하여 측정됩니다 ~ 1 J/m2/sec의 노출 율을 생산하는 15 와트 살균 램프에....

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Discussion

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UV - 유도된 손상의 존재와 부재의 야생 타입 세포에서 얻은 전형적인 결과는 그림 1에 표시됩니다. 세포가 급속하게 기하 급수적으로 성장 단계에있을 때 손상이없는 경우, 전체 플라스미드 DNA의 ~ 1 %가 Y 아크에서 찾을 수 있습니다. 차단 복제 포크가 손상 사이트에서 축적으로 조사에 따라, Y 모양 분자의 일시적 증가가 관찰됩니다. X - 모양의 복제 중간체는 또한 transiently 병변이 수리하는 경우와 상호 때까지 축적과 유지.

남부 분석 장소에서 복제 중간체는 정화, 플라스틱 빨대로 젤 밖으로 천공 수 있고, 전자 현미경으로 직접 관찰했다. 우리는 DNA 손상을 발생하고 이러한 돌연변이의 축적 이상 복제 중간체를 식별하는 복제 포크를 처리하는 데 필요한 유전자 제품을 식별하는 데 성공적으로이 방법을 사용했습니다. 또한,이 방법은 쉽게 DNA 손상의 다른 형태를 조사하기 위해 수정할 수 있습니다.

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Disclosures

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리가 실험실에서 작업이 NIGMS - NIH의 국립 과학 재단 (National Science Foundation)와 지역 부여 R15GM86839에서 경력을 수상 MCB0551798에 의해 지원됩니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2D 겔의 남부 분석의 한 예로, GEHealthcareG15T8Yellow Lighting
15 μ 와트 살균 램프SylvaniaF20T12/GOUV 램프
Blak-Ray UV 강도 측정기 254nmDaiggerEF28195T UVC 광도계
0.025 μ m pore disksWhatman, GE 헬스케어VSWP04700플로팅 투석 디스크
PvuIIFermentasER0632Restriction Endonuclease
Nick-translation kitRoche Group976776To make 32P-labeled probe
Blotting PaperWhatman, GE Healthcare3030-704For Southern
Transfer Nylon membraneGE HealthcareRPN203S남부 환승의 경우

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
  2. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regres....

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Two dimensional Gel ElectrophoresisDNA Replication IntermediatesUV induced DNA DamagePlasmid PBR322 AnalysisAgarose Gel AnalysisSouthern BlottingRestriction Enzyme DigestionAlkali Transfer SystemReplication Fork ReversalNucleotide Excision Repair

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