방법 논문

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

DOI:

10.3791/2243

⸱

2010년 12월 30일

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine, 4Research Medicine, Veterans Affairs TVHS, Vanderbilt University School of Medicine

이 논문에서

요약

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Zebrafish는 강력한으로 등장했습니다 생체내에 플랫폼입니다. 여기, 우리는 zebrafish 배아를 사용하는 작은 분자의 대규모 심사 간단한 실용적인 방법을 보여줍니다.

초록

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그들의 작은 배아 크기, 신속한 개발, 투명성, 생산력, 그리고 포유류에 수많은, 분자 및 생리 형태학의 유사성을 감안할 때, zebrafish는 강력한으로 등장했습니다

프로토콜

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1) Zebrafish 에그 컬렉션

  1. 이전에 화학 화면의 하루 오후, 10-20 zebrafish 사육 탱크를 설정합니다. 양식업 시스템에서 물을 각각의 탱크를 채우십시오. 물고기 그물을 사용하여 각각의 사육 수조 내부 컨테이너 한 성인 남성과 1-2 성인 여성을 전송할 수 있습니다. 구분선 서로의 남성과 여성의 생선을 분리합니다. 새장을 분류하고 그들을 통해 뚜껑을 넣어.
  2. 화면의 아침, 사육 탱크에서 디바이더를 제거하고 짝짓기 zebrafish하실 수 있습니다. 다음 1 시간 과정 동안 수정된 계란 각 내부 컨테이너의 하단에 그리드를 통해 가을 수 있습니다.
  3. 일시간 후, 영구 저장 탱크로 성인 zebrafish를 반환하는 내부 용기를 제거하고 플라스틱 차 스트레이너를 통해 각 사육 탱크에 물을 긴장하여 계란을 수집합니다.
  4. 페트리 접시 위에 스트레이너를 반전하고 E3 매체를 포함하는 세척 병을 사용하여 페트리 접시에 계란을 내리려고 부드럽게 스트레이너를 씻어.
  5. 불투명 나타나는 모든 unfertilized 계란은, 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 삭제해야합니다. 각 짝짓기 크로스는 약 200 배아를 얻을 것입니다.

2) 96 - 웰 플레이트에 배아를 Arraying

  1. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 E3 중간에 5 배아에 대한 전송합니다.
  2. 소중히 배아를 치료하지 복용, 피펫 - 일단 태아가 96 - 웰 플레이트에 못하였 느니라 있으며, 12 채널 (300 μL 30)를 사용하여 우물 밖으로 가능한 한 많은 E3​​ 매체를 제거합니다. 12 채널 피펫을 사용하므로 같은 배아가 건조하지 못하게하는 것이 아니라 가능한 한 빨리 각각 0.5μg/ml kanamycin을 포함 E3 매체를 250 μL를 제공합니다.
  3. 화합물을 추가할 때 그들이 원하는 무대를 도달할 때까지 28.5 ° C 배양기로 96 - 웰 플레이트 놔.

작은 분자 도서관 3) 전송

복합 전송이 로봇 전송 방법으로 자동화할 수 있지만, 우리는 수동 전송 방법을 설명합니다.

  1. 작은 분자 라이브러리는 일반적으로 10 MM 재고로 DMSO에 저장된 각각의 화합물로, 96 - 웰 형식으로 제공됩니다. 화합물이 추가 될 때 태아의 단계에 도달 약 60 분 전에, 작은 분자의 aliquots (소​​스 판)이있는 96 - 웰 플레이트에 원하는 숫자를 녹여. 소스 접시의 시리얼 또는 기타 식별 번호를 기록해 둡니다. 접시에 응축을 최소화하기 위해 해동은 Drierite을 (WA 하몬드 DRIERITE CO, 제니아, OH) 포함하는 건조 챔버에서 발생할 수 있습니다.
  2. 간단히 멀티 웰 플레이트 어댑터가 장착된 탁상 원심 분리기에서 접시를 스핀 다운.
  3. 소스 판에서 알루미늄 실링 테이프를 제거합니다. 12 채널 피펫을 사용하여 0.5 mm의 농도 (예를 들어, 10mM 재고 250 NL의 aliquots 시작하는 경우, 각 잘하는 DMSO의 4.75 μL 추가)하는 소스 접시에있는 성분을 희석.
  4. 96 - 웰 플레이트에 배아 (받는 접시) 원하는 단계에 도달하면,를 포함하는받는 사람 접시에 소스 접시에서 화합물의 2.5μL (0.5mM)을 전송하는 12 채널 (2-20 μL) 피펫을 사용하여 배아.
  5. 받는 사람 배아 접시에있는 소스 접시의 식별 번호를 기록합니다. 지금 뚜껑과 함께 배아와 화합물을 포함하는받는 사람 번호판 커버, 부드럽게 부드럽게 소용돌이 치는하여 번호판을 혼합하고, 28.5 ° C 배양기에서 그들을 놓으십시오.
  6. 장기 저장을위한 -80 ° C 냉동고에 알루미늄 씰링 테이프 및 장소 사용되지 않은 작은 분자 (0.5 MM)를 포함하는 각 소스 판 표지.

Phenotypes의 육안 검사에 의해 작은 분자의 효과에 대한 4) 심사

  1. 이전 화면을 수행하는 "히트"를 구성하는 것이 무엇에 대한 구체적인 기준을 수립.
  2. 개발에 원하는 시간에, 인큐베이터에서 화합물 - 처리 배아를 포함하는 96 - 웰 플레이트를 제거하고 stereomicroscope 아래의 각 우물을 확인합니다. 이러한 순환 패턴의 변화 등 미묘한 변화를보다 효율적으로 시각화 들어, 단계 - 대비 바뀌 현미경을 사용할 수 있습니다. 형광 현미경은 조직 특정 발기인에 따라 GFP 또는 DsRed 단백질의 표현의 섭동을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 신속하게 5 배아 밖으로 적어도 3 소정의 "히트"표현형을 전시 어느 잘 대해 96 - 웰 플레이트를 검사합니다. 판 각 잠재적인 충돌의 잘 위치의 신원을 기록합니다.
  4. 여러 복용 (1 음, 5 음, 10 μm의 및 50 μm의)의 화합물의 효과를 다시 테스트하여 잠재적인 충돌을 재확인. 각 복용량을 위해, 10 배아는 48 웰 플레이트 형식 E3 미디어 0.5 ML에서 테스트합니다. 다시 테스트를위한 화합물 이외의시기는 원래 심사의 동일해야합니다. 조회 elicited 표현형이 compoun의 다시 테스트를 재현 때 확인D
  5. 화학 라이브러리에 작은 분자의 데이터베이스에서 히트 화합물을 식별합니다.

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토론

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zebrafish 기반 화학 화면을 계획하는 경우 특히주의가 고려에서 표현형 및 표현형의 배경 율의 견고에 지불되어야합니다. 이것은 유도 표현형 화학 진압을 위해 스크린에 특히 중요합니다. 예를 들어, transgene의 열 - 충격 유도에 의한 표현형 들어, 표현형을 유도 조건 reproducibly 정확하게 unacceptably 높은 거짓 긍정적인 요금을 피하기 위해 화면을 시작하기 전에 밖으로 매핑해야합니다. 주의 계획과, 겸손한 자본 투자를 필요로 zebrafish 화학 화면, 세포 신호 및 생리학의 소설 변조기의 발견뿐만 아니라, 인간 질병 모델을 반대로 리드 화합물을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 고전적인 앞으로 유전 화면에 비유하여 zebrafish 기반 화학 화면 기본적인 생물 학적 과정의 화학 유전 해부에 대한 가치 수 있습니다.

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

재료

  1. 원하는 유전자형의 성인 zebrafish의 20쌍 최소.
  2. 이동식 내부 컨테이너와 디바이더 (수생 서식지)와 물고기 그물, 사육 탱크.
  3. 배양 접시 (10cm).
  4. 플라스틱 티 스트레이너.
  5. 병 containg 배아 물을 씻으십시오.
  6. 일회용 폴리에틸렌 전송 pipettes.
  7. 폴리스티렌은 96 - 잘 왕복 하단의 분석 플레이트 (코닝 코스타, 로웰, MA).
  8. 유리 파스퇴르 피펫 (피셔 과학).
  9. 수동 피펫 펌프, 10 ML (벨 - 예술 제품, 페콰녹, NJ).
  10. E3 배아 매체 : 0.003 % PTU을 (phenylthio - carbamide, 시그마, 세인트 루이스, MO)가 포함된 5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.33 MM MgSO 4. PTU는 E3 배아 미디어 1 L에서 0.3 - G PTU를 용해하여 10X 솔루션으로 준비하실 수 있습니다. PTU를 포함하는 솔루션은 알루미늄 호일로 덮고의 빛으로부터 보호되어야합니다.
  11. 12 채널 pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
  12. 12 채널 pipettes, 3에서 300 사이 μL (Eppendorf).
  13. 일회용 피펫 폴리스티렌 분지, 50 ML (피셔 과학).
  14. DMSO 10 MM 주식에서 96 못할거다 형식 못하였 느니라 구조적으로 다양한 화합물의 작은 분자 라이브러리입니다. 각 마스터 판은 96 잘 폴리 프로필렌 저장 플레이트 (코닝)로 aliquoted하고, -80 ° C에서 사용할 때까지 저장됩니다.
  15. 알루미늄은 (Nunc, 로체스터, NY) 96 - 웰 플레이트에 대한 테이프를 씰링.
  16. DMSO (시그마, 세인트 루이스, MO).
  17. 기본 인큐베이터, 28.5 ° C (피셔 과학).
  18. 전송 라이트베이스 (Leica 이크로 시스템즈, 배녹번, IL)로 Stereomicroscope.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bayliss, P. E. Chemical modulation of receptor signaling inhibits regenerative angiogenesis in adult zebrafish. Nature chemical biology. 2, 265-273 (2006).
  2. Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
  3. Hao, J. In vivo structure-activity relationship study of dorsomorphin analogues identifies selective VEGF and BMP inhibitors. ACS chemical biology. 5, 245-253 (2010).
  4. Hong, C. C., Peterson, Q. P., Hong, J. Y., Peterson, R. T. Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling. Curr Biol. 16, 1366-1372 (2006).
  5. Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107, 1355-1358 (2003).
  6. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12965-12969 (2000).
  7. Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nature chemical biology. 4, 33-41 (2008).
  8. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature reviews. 4, 35-44 (2005).
  9. Stern, H. M. Small molecules that delay S phase suppress a zebrafish bmyb mutant. Nature chemical biology. 1, 366-370 (2005).
  10. Peterson, R. T. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature biotechnology. 22, 595-599 (2004).

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