BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로 표현됩니다 Xenopus의 oocytes 메신저 RNA를 주입하여. 패치 클램프 레코딩하는 동안 세포 솔루션은 재관류 시스템에 의해 제어됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에 제시 프로토콜은 대형 전도, 전압 및 칼슘 2 + - 활성 K + (BK)이 채널의 활성화를 연구하기 위해 설계되었습니다. 프로토콜은 다른 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체 1 구조 - 기능 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. BK 채널 널리 여러 조직에서 표현되고 평활근의 수축 규제, 내부 세포의 주파수 튜닝 및 신경 전달 물질 릴리스 2-6 규제 등 많은 생리 기능에 연루되어있다. BK 채널 막에 의해 탈분극 및 세포내 칼슘 2 +와 MG 2 + 6-9로 활성화됩니다. 따라서 프로토콜은 막 전압과 세포내 솔루션을 모두 제어할 수 있도록 설계되었습니다. 이 프로토콜에서는 BK 채널 메신저 RNA는 18 ° C 10-13에서 부화 후 2-5 일 뒤에 Xenopus laevis의 oocytes (무대 V - VI)에 주입합니다. 하나 또는 여러 개의 BK 채널을 포함하는 막 패치는 내부 아웃 구성을 패치 클램프 기법 10-13 사용에 excised됩니다. 패치의 세포 측면은 서로 다른 조건에서 채널 정품 인증 심사 수 있도록 녹음 중 원하는 솔루션을 perfused 있습니다. 요약하면, BK 채널의 mRNA는 oocyte 막에 채널 단백질을 표현하는 Xenopus laevis의 oocytes로 주입되며 패치 클램프 기법 제어 전압과 세포내 솔루션에서 채널을 통해 흐르는 전류를 기록하는 데 사용됩니다.
프로토콜
1. Oocytes에 mRNA의 분사
- 0.05을 주사 - Nanoject II 자동 Nanoliter 주입기 (드루먼드 과학 회사, 모델 3-000-204)를 사용하여 Xenopus laevis의 oocytes (무대 V - VI)로 체외에서 베꼈는데했습니다 50 NG 전령 RNA합니다. 각각의 mRNA에 대한 열 oocytes에서 주사를 반복합니다.
- 두 번 사용하여 주입 oocytes 씻어 ND를 - 96 솔루션 (96 MM 나트륨 염화물 (NaCl, 미스터 58.44 g / 몰), 2 MM의 칼륨 염화물 (KCl, 미스터 74.56 g / 몰), 1.8 MM의 염화칼슘 (CaCl 2 • 2 시간 2 O 씨 147.02), 1 MM 마그네슘 염화물 (MgCl 2 • 6H 2 O 씨, 203.31 g / 몰), 5 MM 4 - (2 - 히드록시 에틸) - 1 - piperazineethanesulfonic 산 (HEPES, 미스터 238.31 g / 몰), 2.5 MM 나트륨 pyruvate (씨 110.04 g / 몰) 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신. 산도 7.6)은 다음 18 문화 판과 부화에 배치 ° 2 +의 일 C.
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토론
oocyte 표현 시스템은 내생 채널 상대적으로 낮은 배경에 의한 전압 - 의존 이온 채널의 electrophysiological 특성에 이상적입니다. 또한, 그것이 일시적 표현 시스템이기 때문에, 그것은 이러한 채널의 돌연변이 유발 연구를 수행하는 효율적인 방법을 제공합니다. 그러나, 그것이 oocyte 표현 시스템은 포유 동물 세포에서 다른 것을 지적해야하므로 다른 subunits와 포스트 translational 수정 및 결사의 차이가있을 수 있습니다. 또한 지질 농도는 채널의 기능적 속성을 영향을 미칠 수있는 두 셀 사이에 다를 수 있습니다.
재관류의 tubings, 연필과 팁은 DI 워터와 방해할을 피하기 위해 실험 후 매번 청소해야합니다. 항상 그것이 녹음이 정확합니다 그렇지 않으면, AgCl로 코팅되어 있는지 확인하는 자세 전극 와이어를 치료하기 위해 새로운 표백제를 사용합니다. 테스트 잠재력이 명령 잠재력을 정확히 동일하므로 데이터 수집에 대한 구성 설정을 조정.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 보조금 R01 - HL70393 및 JCJC에 R01 - NS060706 국립 연구소에 의해 지원되었다 스펜서 T. 올린 엔다우먼트에 의생명 공학 교수이다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Nanoject II 자동 나노리터 인젝터 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| P-97 화염/브라운 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 관류 시스템 및 전자 컨트롤러 | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | 관류 팁 내경: 100 microns |
| 도립 현미경 | Olympus Corporation | CKX31 | |
| 유리 피펫 | VWR international | 53432-921 | |
| 화염/브라운 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 증폭기 | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| 컴퓨터 인터페이스 | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| 헤드스테이지 | Axon Instruments | CV 203BU |
참고문헌
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y.
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재인쇄 및 허가
