Method Article

Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석

DOI:

10.3791/2344

⸱

December 8th, 2010

 ,  ,  ,  , 
1Laboratório Nacional de Céulas-Tronco Embrionárias (LaNCE), Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brazil

In This Article

Summary

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정지 성장 Pluripotent 줄기 세포가 embryoid기구 (EBS)에 구별. 집합체로 조직을 보존하면서 여기에서 우리는 embryogenesis의 세포 및 분자 측면을 연구하는 데 유용 고품질 EB의 cryosections를 얻는 방법을 보여줍니다.

Abstract

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배아 줄기 (ES) 세포가 blastocyst 단계 초기 포유류의 배아 1의 내부 세포 덩어리에서 파생된 pluripotent 세포 수 있습니다. ES 세포의 분화에 중요한 단계는 embryoid 기관의 형성 (EBS) 집계 2, 3입니다. ES 세포가 아닌 자기편 접시에서 양식 때 EB의 형성은 자연 집합을 기반으로합니다. ectoderm, mesoderm 및 endoderm 4 : 입체 EB의 recapitulates 많은 초기 포유류의 embryogenesis의 측면 및 세 세균 층에 구별.

Immunofluorescence 및 현장 하이브리드화에 널리 조직 제 5, 6, 7 세포에있는 목표 단백질 및 mRNA의 검출 기술을 사용합니다. 여기 embryoid 기관의 고품질 cryosections를 생성하는 간단한 기술을 제시한다. 이러한 접근 방식은 OCT에서 EB의 포함의 공간적 방향 cryosection 기술 다음에 의존합니다. 그 결과 섹션은 특정 단백질, RNA 또는 DNA를 포함한 세포의 인구를 특성화하기 위해 분석 절차의 다양한 받게 수 있습니다. 이러한 의미에서, EB cryosections의 준비 (10μm)은 조직학 얼룩의 분석을위한 필수 도구 (예 : Hematoxilin과 Eosin, DAPI), immunofluorescence (예 : Oct4, nestin) 또는 현장 하이브리드화에 있습니다. 이 기술은 또한 EBS의 트라이 차원 구면 구조의 유지 보수 관련하여 embryogenesis의 측면을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

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1. 고정 및 Cryopreservation

Pluripotent 줄기 세포는 fibroblast의 성장 인자의 20 % 녹아웃 혈청 대체 (KSR) 및 8ng / ML (FGF - 2)와 보충 mitomycin C와 inactivated과 DMEM/F12 유지 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEF)에 교양되었습니다. EB 형성을 유도하기 위해서는 H9 세포가 아닌 자기편 요리로 전송 15 % KSR 8 보충 DMEM/F12 유지 칠일에 대한 교양되었습니다.

참고 (!) :이 기술은 모든 배아 및 유도 pluripotent 줄기 세포에서 파생된 EBS 사용할 수 있습니다.

  1. 피펫과 문화 요리에서 EBS를 수집합니다.
  2. 재료 튜브의 바닥에 싱크까지 전송 15 ML 원뿔 관에 EBS하고 기다립니다.
  3. 미디어를 제거하고 실온에서 30 분간 PBS에서 4 % paraformaldehyde (PFA) 솔루션과 EBS를 수정.
    참고 (!) : 현장 하이브리드화 항원 복구에 들어 PFA 6,7의 사용으로 인해 항체와 교차 연결 반응을 방지하기 위해 수행되어야합니다.
  4. PFA 솔루션을 제거하고 5 분 PBS로 세척.
  5. EBS는 25-28에서 PBS 버퍼 자당 솔루션의 시리얼 희석 (순서대로 10, 20, 30 %)에 배치되어야 ° C, 각 솔루션은 매 30 분 교체해야합니다. 자료는 다음 OCT로 퍼가기 단계까지 4 30 % 자당 용액 ° C에 갖춰져 수 있습니다.

2. 조직 퍼가기,지도 및 냉동

  1. 조심스럽게 튜브에서 EBS를 수집합니다. 가능한 한 배출 많이 자당 솔루션입니다.

    참고 (!) : EBS를 수집하기 전에 자당 솔루션 팁의 내부 벽에 싸하는 것이 중요합니다. 이 절차는 제보에 첨부된 수 EB를 피할 수 있습니다.
  2. 금형에 EBS를 삽입 및 필터 종이에 남아있는 자당 솔루션을 제거합니다.

    참고 (!) : 중복 피하기 위해 EBS와 금형을 기입하지 않는 것이 중요합니다.
  3. EBS를 다시 정지하지 돌보는 천천히 OCT와 금형을 입력합니다. 그 후, 금형의 중심에 모두 EB를 놓고 피펫과 거품을 제거합니다.
  4. 가벼운 15 분 동안 선동.
  5. 예제를 동결하는 조각 드라이 아이스와 금형을 포위하라. OCT 완전히 얼어해야합니다. 이 시점에서 블록은 하나 이상의 년, -70 ° C에 저장할 수 있습니다.

3. 기술 Cryosectioning

  1. -70에서 냉동 블록을 제거 이전에 -18과 -21 사이의 온도에서 냉각 그라 이오 스탯에 대한 ° C 및 장소 ° C.

    참고 (!)이 범위 밖의 온도가 부분과 같은 문제가 컬링 용융 또는 균열이 발생할 수 있습니다.
  2. 금형에서 OCT 블록을 분리보다 OCT를 추가하여 그라 이오 스탯 지원에 넣습니다.
  3. 그것은 제대로 방향 블록을하는 것이 중요하며 칼날의 가장자리에 병렬 정렬합니다.

    참고 (!) : EBS 다른 조직 샘플보다 작은 있기 때문에,이 단계는 자료의 손실을 최소화하기 위해 매우 중요합니다.
  4. 표면 비행기를 얻을 때까지 OCT 블록 피상적으로 sectioned해야합니다. 조직 표본의 얇은 부분 (10μm)은 이전에 200 MG / ML 폴리 리신 L (슬라이드 당 10 μL) 9,10와 코팅 슬라이드 촬영과 유리에 장착해야합니다.

    참고 (!) : torned 섹션을 방지하려면 블레이드에서하는 어떠한 손해에주의를 기울이십시오.
  5. 모든 섹션이 있어야 공기 건조 상온에서 1 시간 후 사용하기 전까지 사용하거나 -70 ° C에 저장된을 수 있습니다.

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Discussion

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방법은 여기에 설명된 것은 제공하는 쉬운 따라 immunofluorescence 및 현장 하이브리드화 assays에 유용 embryoid 기관의 PFA 고정 얇은 그라 이오 스탯 섹션을 얻기 위해 프로토콜을. 집합체로서의 구조와 조직을 보존하면서 결과 cryosections은 인간 배아 줄기 세포의 분화의 세포 및 분자 측면의 연구를 허용합니다.

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Disclosures

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 Fundação 드 Amparo에 의해 지원되었다 Pesquisa 에스타도하나요 리우데 자네이루 (FAPERJ), Conselho 나셔널 드 Desenvolvimento Científico 전자 Tecnológico (CNPq)과 Instituto 나셔널 드 Ciência E Tecnologia (INCTC). 우리는 브루나 S. 폴슨과 EB의 이미지 앨린 M. 페르난데스에게 감사하고 있습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
D (+) 자당시약Vetec228
파라포름알데히드시약Rieden-de Haë n16005
PBS 용액시약LGC Biotecnology13-30259.05
폴리-L-라이신 하이드로브로마이드시약Sigma-AldrichP2636200mg/mL in water
Tissue-Tek O.C.T. 복합시약Sakura FinetekP2636
자당 용액시약10% 자당 용액(PBS w/v)
자당 용액시약20% 자당 용액 PBS w/v
자당 용액시약PBS 30% 자당 용액 w/v
원뿔 튜브도구Techno Plastic 제품9101515mL 원추형 튜브
플레이트 셰이커도구바이오믹서
저온 유지 장치도구Leica MicrosystemsCM 1850
OCT 플랫폼용 금형도구플라스틱 금형 플랫폼

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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