암컷 마우스 모델에서 유방 종양 진행의 생물발광 이미징

초록

근원:
마리나 아란테스 라디키¹, 빅터 카를로스 멜로¹,
빅토리아 파스 마차도¹, 마르시아 크리스티나 올리베이라 다 로샤¹, 자클린 바즈 데 올리베이라¹, 루아나 크리스티나 카마르고^1,2, 루이스 알렉상드르 뮐만¹, 리카르도 벤테스 아제베도¹, 소니아 나이르 바오¹, 주앙 파울로 피게이로 롱고<sup>1

1</sup>브라질리아 대학교 생물과학연구소, ²브라질리아대학교 심리학연구소 기초심리과정학과

이 비디오는 루시페라아제 발현 유방 선암종 세포를 암컷 마우스에 주입하고 생물발광 신호를 모니터링하여 시간 경과에 따른 원발성 및 전이성 종양 성장을 평가함으로써 생체 내에서 종양 진행을 추적하는 절차를 보여줍니다

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 세포 배양

1. 쥐 유방 선암종 세포인 4T1 세포주(ATCC-CRL-2539)를 10% 소 태아 혈청(v:v), 페니실린(100U/mL) 및 스트렙토마이신(100U/mL)이 보충된 DMEM 배지(Dulbecco의 변형 독수리 배지)로 배양하여 37°C에서 5% CO₂를 함유한 가습 분위기에서 유지합니다.
2. 루시페라아제를 발현하는 Luc2 유전자로 원래 세포주를 형질감염시킵니다. 이 생물발광 효소는 구성적으로 생성됩니다.

2. 동물 모델 - 종양 세포 이식

1. 생물발광, 루시페라아제 발현 4T1 세포(마우스당 2 × 10⁵ 세포)를 마취 하에 Balb/c 암컷 마우스의 왼쪽 등쪽에 피하 접종합니다(각각 80mg/kg 및 10mg/kg의 케타민 및 자일라진).
   1. 이 절차의 경우, 지정된 마취제(각각 80 및 10 mg/kg의 케타민 및 자일라진)의 복강 내 주사를 사용하여 실험 전에 마우스를 마취합니다.
   2. 마취 유도 5분 후, 마우스를 면도하고 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 세포를 피하 주입합니다.
      참고: 각각 무게가 약 25g인 총 5마리의 8주령 마우스를 종양 유도 및 이미징에 활용했습니다.
2. 생체 내 종양 성장을 정량화하기 위해 4주 동안 종양 성장을 모니터링하여 생물발광 이미징으로 종양 보유 마우스를 평가합니다.
   1. 바이오이미징 실험의 경우, 이소플루란(정제된 압축 공기에서 2.5% 희석)으로 마우스를 마취합니다. 종양 진행을 평가하려면 생물발광 신호를 측정하는 장비를 사용하여 4주 동안 일주일에 한 번 마우스를 이미지화합니다.
      메모: 4T1-luc 루시페라아제 생물발광 신호는 성장을 평가하고 종양 진행을 나타내기 위한 매개변수로 활용되었습니다.
3. 이미징 과정에서 마우스를 장비의 지정된 영역 내에서 등쪽으로 눕힌 위치에 배치하여 생물발광 이미지를 캡처합니다.
4. 마취 후, 마우스에게 D-루시페린(100μL; 15mg/mL)을 복강 내 주사합니다.
   메모: D-루시페린은 절단 시 광자를 생성하는 루시페라아제 효소의 기질이고, 4T1-생물발광 루시페라아제 세포는 이 효소를 구성적으로 발현하기 때문에, 살아있는 동물에서 종양을 정량화하고 검출한다.
5. 신호를 감지하려면 각 종점에서 각 동물에 대해 20분에 걸쳐 20개의 생물발광 이미지를 캡처합니다. 이러한 각 이미지는 60초 동안 방출되는 생물 발광 신호를 나타냅니다.
6. 매분 방출되는 신호를 나타내는 생물 발광 동역학 곡선을 구성합니다. 각 동물에 대한 최적의 결과를 보장하려면 각 종점에 대한 최대 생물 발광 방출을 기록하십시오.
7. 생물발광 이미지 캡처의 경우 방출 필터 열림, 여기 없음, 비닝 8, f/스톱 2 및 시야 유형-D 매개변수를 사용합니다. 성장 곡선을 생성하려면 총 4주 동안 일주일에 한 번 동물을 이미지화합니다.
8. 생물발광 이미징 - 원발성 종양 및 폐 전이.
   1. 원발성 종양과 폐 전이 신호를 구별하려면 장비의 소프트웨어를 사용하여 특정 관심 영역을 정의하십시오.
   2. 세포가 전이된 주사 부위와 흉부 부위에서 생물발광 신호를 식별합니다. 이 이미지를 기반으로 종양 진행과 밀접한 상관관계가 있는 생물발광 신호의 진행을 계산합니다.
   3. 몇 주에 걸쳐 수집된 이미지를 사용하여 원발성 종양 및 전이성 병변을 포함한 다양한 종양 부위에 대한 성장 동역학 프로필을 생성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
D-루시페린	퍼킨 엘머	122799	화학 시약
Dulbecos의 변형 Eagle's médium	깁코	A7030	세포 배양 배지
태아 소 세럼	머 크	F2442	세포 배양 배지 보충제
이소플루란	크리스탈리아	NA	마취제
IVIS 루미나	XR	시리즈 III	장비 – 미국
페니실린	머 크	P4333	세포 배양 항생제
팔로이딘-알렉사 플루어 488	써모 피셔	A12379	화학 시약
인산염 완충 식염수	머 크	4437568	화학 시약
스트렙토마이신	머 크	P4333	세포 배양 항생제