옵소니즈드 적혈구를 이용한 보체 매개 식세포작용 모델 in vitro

Abstract

출처: Nagre, N. 외 마우스의 폐포 대식세포 섭취와 박테리아 제거. J. Vis. Exp. (2019).

이 영상은 IgM과 보보체로 옵소니시된 양 적혈구를 이용한 보체 수용체 매개 식구 평가를 시연하며, 이후 쥐 대식세포에 의한 흡수를 보여줍니다. 식의 정도는 헤모글로빈 촉매에 의해 산화된 디아미노플루렌의 청색색 생성 산물을 측정하여 정량화됩니다.

Protocol

1. FcγR 및 CR 매개 식세포작용

1. 옵소니제이션을 위해, 양 적혈구 2개를 50 μL 토끼 항-SRBC-IgM 또는 50 μL 토끼 항-SRBC-IgG 50 μL과 실온에서 30분간 배큐합니다.
2. IgM 옵소니제이션된 SRBC를 37°C에서 30분간 인큐베이트하여 C3b 및 C3bi 상체 조각을 IgM 코팅 SRBC에 고정시킨다.
3. 종자 쥐 대식세포(MH-S 세포)(10,000 세포/웰)를 96웰 플레이트에 넣고 하룻밤 배양하여 ~70% 합류율을 얻습니다. MH-S 세포 각 웰에 100 μL 10 x 10 7/mL 옵소니제이션 SRBC를 추가하고 37 °C에서 1시간 배양합니다. 결합되지 않은 SRBC는 100 μL 암모늄 클로라이드-칼륨(ACK) 용해 완충제로 매우 빠르게(~1분) 세척합니다.
4. 세포를 0.1% SDS로 용해하고, 3% 과산화수소와 6M 요소 함유의 2,7-디아미노플루오렌(DAF) 50 μL을 첨가합니다. 헤모글로빈 촉매에 의해 형성된 플루오렌 블루 형성의 흡수도를 620 nm에서 측정합니다.
5. 620 nm 흡광도값의 표준 곡선을 사용하여 알려진 SRBC의 수를 결정합니다. 마찬가지로, 공정 MH-S 세포를 비옵소니제이션된 SRBC와 함께 배양하여 음성 대조군으로 사용한다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,7-디아미노플루오렌 (DAF)	시그마-올드리치	D17106	분자생물학 등급
에탄올 70%	디콘 랩스 주식회사	18C27B	분석 등급
96웰 플레이트	코닝	3603	세포 생물학 등급
ACK 용해 버퍼	라이프 테크놀로지	A10492	분자생물학 등급
C5 결핍 혈청	시그마-올드리치	C1163	생화학적 시약
원심분리기	랩넷 인터내셔널	C0160-R
사이토스핀 4 세포 심심분리기	써모피셔 사이언티픽	A78300101 11호
DMEM 세포 배양 배지	깁코	11995-065	세포 생물학 등급
FBS	애틀랜타 바이오롤리컬스	S11550	세포 생물학 등급
플로우 사이토미터	BD 생명과학	FACSCalibur
플로우 조 소프트웨어	플로우조 LLC
겸자	듀몽	0508-SS/45-PS-1	실험동물 해부에 적합함
유리 바닥 접시	맷텍 코퍼레이션	P35G-0.170-14-C	세포 생물학 등급
고압 주사기	펜-센추리	FMJ-250	실험용 동물 사용 적합
균질기	옴니 인터내셔널	TH-01
과산화수소	시그마-올드리치	H1009	분석 등급
역형광 현미경	올림포스	IX73
마이크로스프레이어 에어로졸라이저	펜-센추리	IA-1C	실험용 동물 사용 적합
파라포름알데히드	시그마-올드리치	P6148	시약 등급
PBS	깁코	20012-027	세포 생물학 등급
토끼 항-SRBC-IgG	MP 생의학	55806	면역 검사에 적합
토끼 반 SRBC-IgM	시더라인 연구소	CL9000-M	면역 검사에 적합
가위	밀텍스	5-2	실험동물 해부에 적합함
양 적혈구(SRBCs)	MP 생의학	55876	세척되고 보존된 SRBC