장내 미생물 풍부화를 위한 카에노르합 딧 벌레의 선택적 세척

초록

출처: 모건, E. 외 장내 미생물군 박테리아를 풍부하게 하기 위한 야생 선 충선충의 선택적 세척. J. Vis. Exp. (2021)

이 영상은 야생 카에노르합딧 벌레에서 관심 있는 장내 박테리아를 분리하는 프로토콜을 시연합니다. 벌레는 먼저 굶주림을 주고 세척하여 표면과 장 내강에서 잔류 영양 박테리아를 제거하면서 표적 미생물을 보존합니다. 표면 세척과 여러 차례의 기어 다니는 단계를 거친 후, 벌레를 해부하여 관심 박테리아가 포함된 장을 추출한 후 수집하여 냉동하여 보관합니다.

프로토콜

1. 장 해리 및 미생물 종의 PCR 식별

1. 동물을 20°C에서 3-4일간 배양하여 굶주리게 하고 OP50-1(대장 균 OP50-1) 박테리아의 양을 줄입니다. 굶은 벌레 접시에 5mL의 M9 배지를 추가하세요.

2. 멸균 유리 피펫과 전구를 사용해 플레이트에서 M9+웜을 피펫으로 채취하여 멸균 15mL 원심분리관으로 옮깁니다.

3. 임상 원심분리기를 사용해 관 안의 벌레를 1000 x g에서 실온에서 30초 동안 회전시킵니다.

4. 멸균된 15mL 피펫을 사용해 튜브 바닥의 살아있는 벌레를 방해하지 않고 상원액을 제거합니다.

5. M9 + 0.05% Triton X-100 100 10mL를 추가하고, 튜브를 뉴테이터 위에서 20분간 배양하여 외부 미생물을 제거합니다. 벌레를 씻기 위해 네 번 반복하세요.

6. 마지막 세척 후, 멸균 피펫 팁을 사용해 100 μL 용액 내에서 펠릿 바닥을 흐트러뜨리지 않고 상원액을 제거합니다.

7. 멸균 피펫 팁을 사용해 M9과 벌레를 씨앗이 없는 NGM 플레이트에 옮기고, 벌레가 기어 다니는 동안 20분간 건조시켜 큐티클과 장에서 OP50-1을 제거하는 데 도움을 줍니다.

8. 건조판에 250 μL M9를 추가하고 유리 피펫을 사용해 M9+벌레를 새로운 시드 없는 NGM 판에 옮깁니다. 다시 말하지만, 접시를 마른 후 벌레들이 20분간 기어 다니게 하세요.

9. 플레이트에 250 μL M9를 추가하고, 깨끗한 시계 유리에 M9 + 웜 100 μL을 옮긴다.

10. 멸균된 26G 주사기 바늘 두 개를 사용해, 한 바늘로 벌레를 눌러 붙잡고 다른 바늘로 벌레를 절단하여 선충을 제거한다. 참수 후에는 장(과립)과 생식샘(투명한 상태)이 자연스럽게 몸 밖으로 나옵니다.

11. 한 바늘로 장을 누르고 다른 바늘로 절단하여 노출된 장자 일부를 잘라냅니다.

참고: 가능하다면 노르마스키 현미경, 형광 현장 하이브리다이제이션(FISH), 면역조직화학 등을 사용하여 관심 미생물이 뒤집힌 장에 여전히 존재하는지 확인하십시오.

12. 단일 해리된 장을 0.5mL PCR 튜브에 10 μL 멸균수를 넣어 옮긴다. 총 5개 이상의 PCR(중합효소 연쇄 반응) 튜브에 대해 반복하여 다양한 동물의 장을 포함합니다.

13. PCR 튜브를 -80 °C에서 최소 5분간 냉동합니다. 냉동실에서 PCR 튜브를 꺼내 샘플을 해동하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	피셔 사이언티브	BP1356
SDS 10%	인비트로젠	AM9822
BD 프리시전 글라이드 니들 - 26 G	피셔 사이언티브	305115
KH₂PO₄	피셔 사이언티브	P-286
나클	피셔 사이언티브	S-671
NH₄Cl	피셔 사이언티브	A-661
스트렙토마이신	밀리포어-시그마	S6501-50G
테트라사이클린	밀리포어-시그마	T7660-5G
트리톤 X-100	피셔 사이언티브	BP-151
시계 안경	VWR	470144-850