방법 논문

쥐 장 절편에서 장내 박테리아의 형광 제자리 하이브리드화

2026년 1월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Ng, K. M., Tropini, C. 장내 미생물-숙주 상호작용의 형광 제 자리 하이브리다이제이션, 렉틴 염색 및 영상 촬영을 통한 시각화. J. Vis. 경험 (2021).

이 영상은 형광 프로브를 박테리아 rRNA(리보솜 리보뉴클산)로 하이브리다이징하여 미세 분석을 위해 숙주 구조를 대염색하여 쥐 장 내 장내 미생물군을 염색하는 형광 현장 잡종화(FISH) 과정을 시연합니다.

프로토콜

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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 심사 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다

  1. FISH(형광 현장 하이브리드화)를 이용한 박테리아 염색
    1. 액체 차단제나 PAP 펜(소수성 장벽 펜)을 사용해 각 조직 절편의 부위를 원으로 표시하여 액체 팽창 범위를 제한하세요. 잉크가 해당 부분과 접촉하지 않도록 주의하세요. 조직과 접촉하지 않고 각 조직 절면에 최대한 가까운 원을 만들어 하이브리다이제이션 용액이 덮어야 할 표면적을 최소화하세요.
    2. 하이브리다이제이션 용액을 준비하라: 50 μL 예열된 하이브리다이제다이제이션 용액마다 0.5 μg 프로브(예: 1 μg/μL 프로브 0.5 μL)를 추가합니다. 하이브리다이제이션 용액을 슬라이드의 섹션에 피펫팅합니다(절면/원형 크기에 따라 ~20 μL). 이 시점부터 배화 과정과 보관 시 교배 용액과 슬라이드를 빛으로부터 보호하세요.
    3. 유연한 플라스틱 커버슬립을 덧씌울 때 사용한 액체의 양이 구간 전체를 덮도록 하세요. 증발을 줄이기 위해 슬라이드를 습한 챔버에서 부양하세요. 습한 챔버를 만들고, 바닥에 과도한 하이브리다이제이션 용액이나 인산염 완충 식염수(PBS)를 적신 물티슈나 종이 타월을 깔아 습도를 조절하세요. 탐침 세트에 따라 45-50 °C에서 >3시간 배양합니다.
    4. FISH 세척 완충액을 예열하세요: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 잠복 기간 동안 0.9 M NaCl에서 50 °C까지 온도를 낮추었습니다. 코플린 병에 슬라이드를 덮을 만큼 충분한 세척 완충제를 준비하세요.
    5. 플라스틱 커버 슬립을 제거하세요; 슬라이드를 50°C로 미리 데워둔 코플린 병에 담긴 FISH 세척 버퍼에 큐베이트하세요. 코플린 병을 다시 50°C 오븐에 넣어 10-20분간 보관하세요. 두꺼운 샘플의 경우, 코플린 병에 넣은 커버슬립을 버퍼를 넣고 부드럽게 떼어내어 조각이 번지지 않도록 하세요.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
코플린 항아피셔08-813E 
커버 유리, 22 × 22 mm, 번호 #1VWRCA48366-227-1 
다피시그마-올드리치D95425 mg/mL로 재현탁
빈 피펫 팁 박스  파라핀을 녹이는 데
FISH 탐사   
FISH 잡종화 솔루션----뉴클레아제 없는 물에서 20 mM 트리스-HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS. 5–50%(v/v) 포름아마이드의 선택적 첨가
어류 세척 완충기----20 mM 삼산-HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl
형광 표지된 Ulex Europaeus 응집체균(UEA-1) 렉틴벡터 연구소FL-1061 (플루오레세인 표지) 또는 RL-1062-2 (로다민 표지)UEA-1은 푸코실화된 글리칸을 표지하므로, 무균 마우스나 푸코실트랜스퍼라제2(FUT2) 결핍 숙주 샘플에는 적합하지 않습니다.
겸자   
HybriSlip 유연한 플라스틱 커버 슬립, 22 x 22 mm × 0.25 mm시그마 올드리치GBL722222FISH 잡종화 단계에서는 유리 커버슬립을 대체할 수 있습니다
ImmEdge 소수성 장벽 PAP 펜벡터 연구소H-4000 
킴와이프스   
다목적 시료 저장 용기, 473 mL피셔14-955-117A원하는 유리나 폴리에틸렌 용기로 대체할 수 있습니다. 메타카른은 폴리스티렌이나 금속과 호환되지 않습니다.
매니큐어전자현미경 과학72180어떤 매니큐어든 괜찮을 거예요
오븐  필요한 온도 범위: 45-60 °C
PBS, 인산염 완충 생리식염수 (10배 용액)피셔BP3991프로토콜을 위해 1배로 희석하세요
염화나트륨피셔S271 
트리즈마 하이드로클로라이드 용액, 1M 트리스-HCl, pH 7.4시그마-올드리치T2663-1L 
뉴클레아제 없는 물로피셔BP2484100 

재인쇄 및 허가

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태그

16S rRNAFISH

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