레 지오넬라 기우모균 외막 소포의 초원심분리 기반 분리

초록

출처: 융, A. L. 외 레지오넬라 폐기구 의 외막 소포: 대식세포에서의 염증 촉진 잠재력의 분리 및 분석. J. Vis. 경험 (2017)

이 영상은 순차적 원심분리, 멸균 여과, 초원심분리를 통해 레지오넬라 폐포 균으로부터 외막 소포(OMVs)를 분리하는 과정을 시연합니다. 정제된 OMVs는 막 단백질과 지다당류가 풍부하여 숙주-병원체 상호작용 연구에 적합합니다.

프로토콜

1. 레지오넬라 폐실병 재배

1. L. pneumophila 균주(야생형, WT)를 완충 숯 효모 추출물(BCYE) 한천 플레이트에 바르고 37°C에서 3일간 배양합니다. 전배양 플레이트에서 L. pneumophila를 OD₆₀₀에서 0.3 OD로 10mL 효모추출물 육수(YEB)를 접종합니다; 박테리아를 37°C에서 회전하는 셰이커(150rpm)에서 6시간 배양합니다.
2. 혈액 한천 플레이트에 100 μL 현탁액을 발라서 액체 배양의 순도를 확인하세요. 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
3. 남은 액체 배양물을 90mL의 신선한 YEB 배지에 넣고, 회전하는 셰이커(37°C, 150rpm)에서 배양하여 OD₆₀₀ (약 16-20시간)을 3.0-3.5로 만듭니다.

2. L. 폐렴균 외막 소포(OMVs) 준비 및 정량

참고: 다음 모든 원심분리 단계는 멸균 조건과 4 °C 환경에서 수행하세요.

1. 액체 배양물을 4,000 x g에서 20분간 원심분리하여 박테리아를 먹이게 하세요. 상원액을 신선한 원심분리관으로 옮기고, 박테리아 펠릿을 버린 후 원심분리(4,000 x g, 20분)를 반복합니다. 이 단계를 한 번 반복하세요.
2. 남은 상정액을 두 번 무균 여과합니다(기공 크기: 0.22 μm). 박테리아가 없는 상청액을 초원심분리관으로 옮기고, 100,000 x g에서 초원심분리기를 3시간 동안 투여합니다.
3. 상정액을 빼내고 버리세요. OMV 펠릿을 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)와 초원심분리기(100,000 x g, 3시간)에 재현탁하여 오염 단백질과 LPS를 제거합니다.
4. 상청액을 버리고 OMV 펠릿을 멸균 PBS 500 μL에 재현탁합니다. 혈액 한천 플레이트와 BCYE 한천 플레이트에 20 μL 스트릭을 하여 준비된 소포에 박테리아 오염을 차단합니다. 혈액 한천 배지를 하룻밤, BCYE 한천 배지를 3일간 배양하세요(둘 다 37 °C).
   참고: L. 폐포균 배양 100mL의 농도는 보통 1 μg/μL입니다. 준비 및 정량된 OMV는 -20 °C에 보관하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 페트리 접시	사르슈테트 AG & Co KG (누엠브레히트, 독일)	82.1473
70 Ti 로터	벡맨 쿨터 법인 (캘리포니아, 미국)	337922
쿠벳	사르슈테트 AG & Co KG (누엠브레히트, 독일)	67.742
헤라셀 240i CO₂ 인큐베이터	서모피셔 사이언티브 독일 BV & Co KG (브라운슈바이크, 독일)	40830469
헤라우스 멀티퓨지 X3R	서모피셔 사이언티브 독일 BV & Co KG (브라운슈바이크, 독일)	75004515
접종 루프	사르슈테트 AG & Co KG (누엠브레히트, 독일)	86.1567.010
L. 폐실아 코비	---	---
PBS	바이오크롬 GmbH (독일 베를린)	L 1825
회전 셰이커 (MaxQ 6000)	서모피셔 사이언티브 독일 BV & Co KG (브라운슈바이크, 독일)	SHKE6000
울트로스펙 10	바이오크롬 주식회사 (케임브리지, 잉글랜드)	80-2116-30
멸균 필터 (기공 크기: 0.22 μm)	코닝 주식회사 (뉴욕, 미국)	431096
활성탄	칼 로스 GmbH & Co KG (독일 카를스루에)	X865.2
아가르-아가르, 고베 I	칼 로스 GmbH & Co KG(카를스루에, 독일)	5210.2
5% 양 피를 가진 콜롬비아 한천	벡톤 딕킨슨 GmbH(독일 하이델베르크)	254005
효모 추출물	칼 로스 GmbH & Co KG(카를스루에, 독일)	2363.2