카에노르합디티스 엘레간스 관련 박테리아의 분리 및 배양

초록

출처: Petersen, C. 외, 모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물군 분리 및 특성화. J. Vis. 경험 (2022)

이 영상은 Caenorhabditis elegans와 관련된 박테리아 종의 분리와 배양 과정을 보여줍니다. 구슬 기반 C. elegans 용해와 선택적 배양을 통해 다양한 미생물 균주를 분리하여 추가 분석을 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 선충 관련 박테리아의 분리 및 배양 (그림 1)

1. 박테리아를 분리하기 위해, 각 웰마다 3개의 멸균 1mm 구슬과 20 μL M9 최소 중간염(M9) 완충제를 넣은 96 웰 플레이트를 준비하고, 각 웰에 세척된 선충을 피펫으로 채워 가능한 한 적은 액체를 옮깁니다.
   참고: 또는 벌레 개체군을 M9-완충제로 플레이트에서 세척하고, 약 300 μL의 벌레 함유 M9-완충제를 10-15개의 구슬이 담긴 2 mL 튜브에 옮길 수 있습니다.
2. 구슬 균질화기를 사용해 선충을 분해합니다(예: 30Hz에서 3분간 구슬 두드기). 액체를 바닥으로 끌어올릴 때 플레이트나 튜브를 잠시 원심분리합니다(예: 상온에서 8000 x g 에서 10초간 RT).
   참고: 이 방법을 사용함으로써 16S 리보솜 DNA(rDNA) 증폭체 시퀀싱에서 발견된 것과 유사한 박테리아 분류군이 분리되어, 설명된 구슬 박동이 대부분의 박테리아 세포를 온전하게 유지함을 시사합니다.
3. 상청액을 채취하고 1:10 비율로 연속적으로 희석한 후 최대 100 μL까지 9cm 한천 플레이트에 판을 적립합니다.
   1. 대부분의 박테리아를 배양할 수 있도록 희석된 트립티카제 대두 한천(TSA, 1:10 희석), 맥콘키 한천, 사부로 포도당 한천, 감자 독도당 한천, 효모 펩톤 금도당 한천 등 영양 조성이 다른 다양한 대체 배지를 사용하세요.
4. 샘플링 장소의 평균 온도 조건(예: 온대 지역의 경우 15-20°C 사이)에서 24-48시간 배큐합니다.
5. 표준 3줄무늬 기법과 멸균 루프를 사용하여 순수한 박테리아 배양을 얻습니다(그림 1).
   1. 멸균 루프나 이쑤시개로 플레이트에서 단일 군락을 골라, 정제에 사용하는 것과 같은 한천 배지를 포함한 새로운 한천 플레이트에 줄무늬를 그려 내세요. 플레이트의 약 1/3만 사용하세요.
   2. 새 멸균 루프를 사용하거나 재사용 가능한 루프를 멸균한 뒤 첫 번째 스트릭을 통과시켜 같은 플레이트의 1/3 부분에 두 번째 스트릭을 만듭니다.
   3. 이 과정을 반복해서 멸균 루프를 두 번째 스트릭 사이에 드래그하세요.
   4. 격리에 사용되는 동일한 성장 조건에서 배양판을 배양하세요. 이 기술은 세 번째 줄무늬 지역에서 단일 군락이 자라도록 해야 합니다.
      참고: 자연 분리물이 바이오필름이나 응집체를 형성하는 경향이 있으므로 정제 단계를 여러 번 반복해야 할 수도 있습니다.
6. 순수 군집을 한천 배지와 같은 종류의 액체 배지에서 위와 같은 온도와 성장 시간(단계 1.4)으로 배양합니다

결과

그림 1: 개별 박테리아의 종 식별 및 분리. 개별 선충은 구슬 균질기를 사용해 분해하고, DNA는 PCR 또는 염기서열 분석을 통해 종 결정을 위해 분리됩니다. 또는 분해된 선충 물질을 연속적으로 희석하여 성장 배지 판에 판재하는 방법도 있습니다. 플레이트는 박테리아 군락이 나타날 때까지 배양되며, 단일 콜로니는 새로운 플레이트에 스트릭을 하여 순수 배양을 얻습니다. 순수 배양의 단일 군락은 액체 박테리아 배양물을 배양하여 -80 °C...