세포 내 박테리아 군집을 포함하는 마우스 방광 상피 세포 분리

초록

출처: 양, E. 외. 요로 감염의 쥐 모델에서 생성된 단일 세포 내 박테리아 군집의 분리, 즉 단일세포 분석을 위한 연구. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 감염된 마우스 방광에서 세포 내 박테리아 군집을 포함하는 단일 상피세포를 입 마이크로피펫팅을 이용해 수동 분리하는 과정을 시연하여, 요로 감염 모델에서 생존 가능한 숙주 관련 대장균 집단의 하위 단일 세포 분석을 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 세포 내 박테리아 군집(IBC) 분리: IBC의 입 피펫팅

참고: 이 절에서 설명하는 모든 방법은 기관 위험 평가를 거쳤습니다. 입 피펫 사용은 전달되는 용액을 섭취할 위험이 내포되어 있습니다. 이 위험은 이 프로토콜이 사용하는 나노리터 용량으로 대체되며, 프로토콜 사용자분들은 여기와 토론에 명시된 예방 및 실무 지침을 반드시 준수하시길 권장합니다.

1. 세포를 PBS(인산 완충 식염수)에 긁어낸 후, 구강 마이크로피펫팅 장치를 설치합니다(그림 1C).
   1. 당겨진 유리 모세관의 두꺼운 쪽(뽑히지 않은 쪽)을 흡입기 튜브의 고무 플러그(흰색 끝)에 삽입합니다.
   2. 1 mL 피펫 팁의 좁은 끝을 흡입관 다른 쪽(빨간색) 끝에 삽입하여 꽉 맞게 합니다.
   3. 2 mL 흡입 피펫의 좁은 끝을 1 mL 피펫 팁의 넓은 열린 끝에 삽입하여 다시 한 번 꽉 맞게 합니다.
      참고: 이 장치는 연구자가 흡입 피펫의 넓고 열린 끝에서 입으로 피펫을 사용하여, 장치 반대편 모세관 좁은 끝에서 부드러운 흡착력을 생성할 수 있게 합니다.
   4. 신선한 탈이온수가 담긴 100mm 페트리 접시를 사용해 최종 입 마이크로피펫팅 장치를 테스트합니다. 흡인용 피펫의 열린 부분에 약간의 흡입 작용(빨대를 통해 음료를 마시는 것과 유사)은 모세혈관 내 액체 농도를 증가시키지만, 탈이온화된 물이 흡인기관으로 넘치는 현상은 없습니다. 한 손으로 모세관을 조절하고, 다른 손으로 페트리 접시의 위치를 조정하세요.
      참고: 단일 IBC를 입으로 피펫팅하는 데 필요한 흡입 강도는 연구자마다 다를 수 있습니다. 하지만 이 기법을 시도하는 모든 연구자는 약한 흡입력으로 시작해 모세혈관을 타고 액체가 흐르지 않으면 천천히 흡입을 늘리는 것이 권장됩니다. 빨대를 빨아먹는 것보다 더 큰 힘은 필요 없습니다. 1.1.4 단계 검사 중 모세혈관이 액체를 흡수하지 않는 것으로 보인다면, 모세혈관이나 흡인 튜브가 막혀 교체가 필요할 수 있습니다. 또한 모든 신규 연구자는 먼저 멸균된 물을 사용해 구강 피펫팅 장치의 흡입을 제어하는 연습을 할 것을 권장합니다. 또한, 입 피펫 장치가 흡수하는 부피의 제어는 연구자의 혀를 통해 이루어진다는 점에 유의하세요. 혀는 가해지는 흡입력의 세기를 미세하게 조절할 수 있으며, 비상 정지 기능도 합니다.
   5. 액체가 성공적으로 흡수된 후에는 흡입 피펫의 열린 부분에 부드럽게 불어 모세관에서 액체를 배출할 수 있는지 테스트합니다. 1.5단계 동안 액체를 배출하는 과정에서 기포가 발생하지 않도록 하여 IBC의 오염을 방지하세요.
      참고: 흡입과 마찬가지로, 연구자가 IBC를 원심분리관으로 배출하기 위해 가하는 양압의 강도는 연구자마다 다릅니다. 이 프로토콜에 처음 익숙한 연구자는 실제 감염 며칠 전에 1.1단계를 연습하는 것이 권장됩니다. 구강 마이크로피펫 연습을 위한 한 가지 제안은 구강 마이크로피펫 장치를 사용해 소량의 멸균된 물을 몇 방울의 식용 색소와 섞어 이동하는 연습을 하는 것입니다(가시성을 위해).
2. 긁어낸 세포 현탁액을 해부 현미경 아래에 놓고 IBC를 대형 형광 집합체로 식별합니다(그림 1A, B). 이상적인 배율 범위는 20-40배입니다. 유리 모세혈관의 미세한 끝을 새로운 PBS 튜브에 1초간 담가하여 모세혈관 작용을 통한 원치 않는 부피의 흡수를 줄이세요.
3. 현미경을 통해 관심 있는 IBC를 식별한 후 모세관의 열린 끝을 천천히 IBC 쪽으로 당깁니다. 유리 모세혈관의 미세한 끝을 사용해 각 IBC 근처의 추가 세포를 쓸어내어 두 개 이상의 세포가 흡인되는 것을 막거나 더 큰 세포 집합체를 분해합니다.
4. 현미경을 통해 관찰할 때, 입 마이크로피펫 장치의 끝(흡인 피펫)에 아주 작은 흡인력을 가하여 IBC를 유리 모세관으로 유도합니다.
5. IBC를 집은 후에는 모세관을 빈 1.5mL 원심분리관으로 옮기고 약간의 양압을 가해 방울과 IBC를 원심분리관 안으로 배출합니다(그림 1D).
6. 현재 방광에서 필요한 만큼 많은 IBC에 대해 1.3-1.6단계를 반복한 후 다음 방광으로 넘어가세요. 침 축적을 방지하기 위해 흡인용 피펫과 모세혈관을 자주 교체하세요.
   주의: 감염성 또는 임상적 박테리아 균주를 다룰 때는 모세혈관 내 용액 수준을 지속적으로 모니터링하세요. 피펫으로 채취되는 액체 양이 모세관 가장자리에서 흡입관 쪽으로 넘치지 않도록 주의하세요. 이런 현상이 발생하면 즉시 다른 흡입관 튜브로 바꾸고 이전 장비를 버리세요.
7. 모든 채취한 방광에 대해 1.2-1.6단계를 반복하거나, 실험군을 위해 충분한 수의 생물학적 샘플이 수집될 때까지 반복합니다.
8. (선택 사항) 모든 실험 그룹(또는 쥐)이 안락사되고 각 그룹에서 충분한 생물 샘플이 채취될 때까지 1.6, 1.7단계를 반복합니다.

결과

그림 1: 방광 세포에서 IBC 채취. (A) 세포 긁기 전에 차가운 PBS 용액에 감염되고 뒤집힌 방광. (B) 현미경으로 본 긁힌 방광 세포의 이미지. IBC는 두 이미지 모두에서 큰 녹색 형광 집합체로 식별할 수 있습니다(빨간 화살표 참조). (C) 완성된 입 마이크로피펫팅 장치의 이미지입니다. 흡인용 피펫, 피펫 팁, ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL 투버쿨린 주사기	BD 생명과학	302100
흡입 피펫	BD 생명과학	357558
흡입관	시그마-올드리치	A5177
현미경용 디지털 카메라	올림포스	DP71	IBC의 이미지 캡처 및 수확을 위해. GFP 채널이 있는 다른 형광 현미경이면 충분합니다
유리 모세관	키맥스	6148K07
아이리스 가위 STR SS 110MM	브라운	BC110R
현미경용 광원 장치	올림포스	LG-PS2	IBC의 이미지 캡처 및 수확을 위해. GFP 채널이 있는 다른 형광 현미경이면 충분합니다
거시 형광 현미경	올림포스	MVX10	IBC의 이미지 캡처 및 수확을 위해. GFP 채널이 있는 다른 형광 현미경이면 충분합니다
마이크로피펫 + 마이크로피펫 팁			정적 박테리아 배양 및 OD 측정을 위한
PBS(인산염 부퍼 생리식염수) 1회			정적 박테리아 배양 및 OD 측정을 위한
폴리에틸렌 튜빙	BD 인트라메딕	427401
스테릴린 90mm 표준 페트리 접시	열학	101VR20	멸균된 페트리 접시라면
스티븐스, 혈관 및 힘줄 가위, 곡선형, 섬세함, 110mm	브라운	OK366R	방광 채취에 권장
수술용 가위 STR S/B 105MM	브라운	BC320R
탁상용 원심분리기	에펜도르프	5810R	15ml 원뿔형 원심분리기를 냉장 보관하는 모든 것이요