$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.
1. 세포 내 박테리아 군집(IBC) 분리: IBC의 입 피펫팅
참고: 이 절에서 설명하는 모든 방법은 기관 위험 평가를 거쳤습니다. 입 피펫 사용은 전달되는 용액을 섭취할 위험이 내포되어 있습니다. 이 위험은 이 프로토콜이 사용하는 나노리터 용량으로 대체되며, 프로토콜 사용자분들은 여기와 토론에 명시된 예방 및 실무 지침을 반드시 준수하시길 권장합니다.
- 세포를 PBS(인산 완충 식염수)에 긁어낸 후, 구강 마이크로피펫팅 장치를 설치합니다(그림 1C).
- 당겨진 유리 모세관의 두꺼운 쪽(뽑히지 않은 쪽)을 흡입기 튜브의 고무 플러그(흰색 끝)에 삽입합니다.
- 1 mL 피펫 팁의 좁은 끝을 흡입관 다른 쪽(빨간색) 끝에 삽입하여 꽉 맞게 합니다.
- 2 mL 흡입 피펫의 좁은 끝을 1 mL 피펫 팁의 넓은 열린 끝에 삽입하여 다시 한 번 꽉 맞게 합니다.
참고: 이 장치는 연구자가 흡입 피펫의 넓고 열린 끝에서 입으로 피펫을 사용하여, 장치 반대편 모세관 좁은 끝에서 부드러운 흡착력을 생성할 수 있게 합니다. - 신선한 탈이온수가 담긴 100mm 페트리 접시를 사용해 최종 입 마이크로피펫팅 장치를 테스트합니다. 흡인용 피펫의 열린 부분에 약간의 흡입 작용(빨대를 통해 음료를 마시는 것과 유사)은 모세혈관 내 액체 농도를 증가시키지만, 탈이온화된 물이 흡인기관으로 넘치는 현상은 없습니다. 한 손으로 모세관을 조절하고, 다른 손으로 페트리 접시의 위치를 조정하세요.
참고: 단일 IBC를 입으로 피펫팅하는 데 필요한 흡입 강도는 연구자마다 다를 수 있습니다. 하지만 이 기법을 시도하는 모든 연구자는 약한 흡입력으로 시작해 모세혈관을 타고 액체가 흐르지 않으면 천천히 흡입을 늘리는 것이 권장됩니다. 빨대를 빨아먹는 것보다 더 큰 힘은 필요 없습니다. 1.1.4 단계 검사 중 모세혈관이 액체를 흡수하지 않는 것으로 보인다면, 모세혈관이나 흡인 튜브가 막혀 교체가 필요할 수 있습니다. 또한 모든 신규 연구자는 먼저 멸균된 물을 사용해 구강 피펫팅 장치의 흡입을 제어하는 연습을 할 것을 권장합니다. 또한, 입 피펫 장치가 흡수하는 부피의 제어는 연구자의 혀를 통해 이루어진다는 점에 유의하세요. 혀는 가해지는 흡입력의 세기를 미세하게 조절할 수 있으며, 비상 정지 기능도 합니다. - 액체가 성공적으로 흡수된 후에는 흡입 피펫의 열린 부분에 부드럽게 불어 모세관에서 액체를 배출할 수 있는지 테스트합니다. 1.5단계 동안 액체를 배출하는 과정에서 기포가 발생하지 않도록 하여 IBC의 오염을 방지하세요.
참고: 흡입과 마찬가지로, 연구자가 IBC를 원심분리관으로 배출하기 위해 가하는 양압의 강도는 연구자마다 다릅니다. 이 프로토콜에 처음 익숙한 연구자는 실제 감염 며칠 전에 1.1단계를 연습하는 것이 권장됩니다. 구강 마이크로피펫 연습을 위한 한 가지 제안은 구강 마이크로피펫 장치를 사용해 소량의 멸균된 물을 몇 방울의 식용 색소와 섞어 이동하는 연습을 하는 것입니다(가시성을 위해).
- 긁어낸 세포 현탁액을 해부 현미경 아래에 놓고 IBC를 대형 형광 집합체로 식별합니다(그림 1A, B). 이상적인 배율 범위는 20-40배입니다. 유리 모세혈관의 미세한 끝을 새로운 PBS 튜브에 1초간 담가하여 모세혈관 작용을 통한 원치 않는 부피의 흡수를 줄이세요.
- 현미경을 통해 관심 있는 IBC를 식별한 후 모세관의 열린 끝을 천천히 IBC 쪽으로 당깁니다. 유리 모세혈관의 미세한 끝을 사용해 각 IBC 근처의 추가 세포를 쓸어내어 두 개 이상의 세포가 흡인되는 것을 막거나 더 큰 세포 집합체를 분해합니다.
- 현미경을 통해 관찰할 때, 입 마이크로피펫 장치의 끝(흡인 피펫)에 아주 작은 흡인력을 가하여 IBC를 유리 모세관으로 유도합니다.
- IBC를 집은 후에는 모세관을 빈 1.5mL 원심분리관으로 옮기고 약간의 양압을 가해 방울과 IBC를 원심분리관 안으로 배출합니다(그림 1D).
- 현재 방광에서 필요한 만큼 많은 IBC에 대해 1.3-1.6단계를 반복한 후 다음 방광으로 넘어가세요. 침 축적을 방지하기 위해 흡인용 피펫과 모세혈관을 자주 교체하세요.
주의: 감염성 또는 임상적 박테리아 균주를 다룰 때는 모세혈관 내 용액 수준을 지속적으로 모니터링하세요. 피펫으로 채취되는 액체 양이 모세관 가장자리에서 흡입관 쪽으로 넘치지 않도록 주의하세요. 이런 현상이 발생하면 즉시 다른 흡입관 튜브로 바꾸고 이전 장비를 버리세요. - 모든 채취한 방광에 대해 1.2-1.6단계를 반복하거나, 실험군을 위해 충분한 수의 생물학적 샘플이 수집될 때까지 반복합니다.
- (선택 사항) 모든 실험 그룹(또는 쥐)이 안락사되고 각 그룹에서 충분한 생물 샘플이 채취될 때까지 1.6, 1.7단계를 반복합니다.
