박테리아에 감염된 쥐 뇌에서 표적 유전자 발현 검출

초록

출처: 장, S. 외. 마우스 감염 모델에서 수막염에서 연쇄상구균 수체 바이오필름의 역할을 조사하기 위한 두개내 지주하 감염 경로. J. Vis. 경험 (2018).

이 영상은 박테리아에 감염된 쥐 뇌에서 표적 유전자 발현을 탐지하는 과정을 보여줍니다. RNA를 추출하여 DNA 분해 효소로 처리한 후 역전사하여 cDNA로 전환합니다. cDNA는 유전자 특이적 프라이머를 이용한 열 사이클링을 통해 증폭되며, DNA 결합 염료가 증폭된 DNA에 결합하여 형광을 방출합니다. 형광 신호를 분석하여 표적 유전자의 존재를 확인합니다.

프로토콜

1. 박테리아 제조

참고: Streptococcus suis (S. suis) 2형 독성 균주 P1/7은 수막염을 앓고 있는 질병 돼지로부터 분리되었습니다. 품종 P1/7은 토드-휴잇 육수(THB, THB 리터당 공식: 심장 주입, 3.1g; 네오펩톤, 20.0g; 덱스트로스, 2.0g; 염화나트륨, 2.0g; 인산나트륨, 0.4g; 탄산나트륨, 2.5g)에서 배양되었으며, Todd-Hewitt 한천(THA, THA당 분포식: 심장 주입, 3.1g; 네오펩톤, 20.0g; 덱스트로스, 2.0g; 염화나트륨) 위에 배양되었습니다. 2.0 g; 인산나트륨 0.4g; 탄산나트륨 2.5g; 한천, 15.0g) 37°C, 5%_CO2.

1. P1/7 플랑크톤 세포 균주 수집
   1. 중간 로그 단계 배양(OD₆₀₀=0.6)에서 플랑크톤 세포 5mL를 채취하고, 8000 × g에서 3분간 원심분리한 후 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척합니다.
   2. 세포를 THB에 넣은 25% 글리세롤 5mL로 재현탁하고, 5개의 튜브로 분리한 후 -80°C에서 보관합니다.
2. 균주 P1/7 바이오필름 상태 세포 수집
   1. 하룻밤 배양한 20mL를 신선한 THB 180mL에 추가하세요; 희석된 배양물을 10개의 원형 배양판으로 균등하게 나누고, 37°C의 5%_CO2 용수에 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.
   2. 배양 후에는 접지판에 달라붙지 않은 박테리아를 부드럽게 흔들어 다시 떠올리게 한 후, 흡인으로 상청액을 버립니다.
      참고: 판을 부드럽게 흔들고 퇴적물을 다시 부유시키지 마세요.
   3. PBS 5mL를 추가하여 바이오필름 상태 세포를 채취하고, 침전물을 완전히 재현탁한 후 샘플을 새 튜브로 옮깁니다.
   4. 마지막 단계의 바이오필름 상태 세포를 다음 매개변수로 초음파 처리합니다: 60 W, 4 사이클, 5초 켜짐, 10초 꺼짐.
   5. 8000 × g에서 3분간 원심분리하고 상청액을 -80 °C에 저장합니다.
      참고: 상청액에는 바이오필름 성분이 포함될 수 있으며, 동물 실험(2단계)에서 설명된 대로 감염 전에 바이오필름 박테리아를 재현탁하는 데 사용할 수 있습니다.
   6. 침전물을 THB에 25% 글리세롤 10mL로 재현탁한 후 바이오필름 상태 세포를 -80 °C에 보관합니다.

2. 동물 실험

1. 이 연구에서는 SPF 6주 된 암컷 BALB/C 마우스를 사용하세요. 모든 쥐는 두개골 지주하 감염 경로를 통해 감염시키며, 이 주입 부위는 브레그마에서 3.5mm 떨어진 곳에 위치해 있습니다.
   1. 조직병리학적 분석을 위해, 플랑크톤 세포 또는 바이오필름 상태 세포를 사용하여 3 ×^{10 7} 콜로니 형성 단위(CFU) 용량으로 두 그룹의 쥐(그룹당 5마리)를 감염시키고, 대조군으로 PBS를 주사한 5마리의 마우스를 투여합니다.
   2. 뇌 내 TLR2와 사이토카인의 mRNA 발현을 위해 플랑크톤 세포 또는 바이오필름 상태 세포를 사용하여 3 ×^{10 7} CFU의 용량으로 두 그룹의 추가 쥐(그룹당 6마리)를 감염시킨다.
   3. THA에 연속 희석액을 도판하여 생존 가능한 박테리아 수를 측정합니다.
   4. 감염 후 12시간 후에 모든 쥐를 안락사시켜 추가 연구를 진행하세요. ​
      참고: 스톡 배지 내 글리세롤은 감염 전에 제거해야 합니다. -80°C에서 회수된 플랑크톤 세포와 바이오필름 상태 세포 모두 PBS로 3회 세척됩니다. 그 후 플랑크톤 세포를 PBS로 재현탁하고 감염에 적합한 용량으로 희석합니다; 바이오필름 상태 세포는 저장된 상청액(Step 1.2.5)과 함께 재현탁되어 감염에 적합한 용량으로 희석됩니다. 감염 용량은 50 μL를 넘지 않아야 합니다.
2. 뇌 조직 내 TLR2와 사이토카인의 mRNA 발현 탐지
   1. RNA 추출 키트를 사용해 뇌 조직에서 총 RNA를 추출하세요.
      1. 각 마우스마다 RNA를 추출하기 위해 뇌 전체 조직을 사용하세요. 뇌 조직 전체를 5개의 관으로 나누세요. 뇌 조직 최대 100mg을 채취하고, 키트에서 제공한 용해 기질이 포함된 각 튜브에 1mL의 용해액을 첨가합니다.
      2. 튜브를 균질제이저에서 6.0 세팅으로 40초간 처리한 후, 12000 × g, 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
      3. 원심분리 후에는 상상을 새로운 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
      4. 옮겨온 샘플을 실온에서 5분간 배양; 클로로포름 300 μL를 추가하고, 10초간 소용돌이 후 실온에서 5분간 배양합니다.
      5. 튜브를 12000 × g, 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상상을 새 튜브로 옮기세요.
      6. 튜브에 500 μL 냉각 절대 에탄올을 넣은 후 5번 뒤집은 후, 샘플을 -20 °C에서 최소 1시간 이상 보관합니다.
      7. 튜브를 12000 × g, 4 °C에서 15분간 원심분리한 후 상원액을 제거합니다. 500 μL 차가운 75% 에탄올로 RNase 무첨가물(H₂O)에 담아 세척합니다.
      8. 에탄올을 제거하고, 펠릿을 실온에서 5분간 자연 건조한 후, RNA를 RNase 프리_H2O 100 μL에 재현탁합니다.
      9. RNA를 실온에서 5분간 인큐베이팅한 후 RNA 바이오분석기를 사용해 RNA 농도를 측정합니다.
   2. 역전사(RT) 시약 키트가 장착된 열사이클러를 사용하여 유전체 DNA(gDNA) 제거를 포함한 상보적 DNA(cDNA) 합성을 수행합니다.
      1. 5x gDNA 제거 완충제 2 μL, gDNA 제거 효소 1 μL, RNase 프리 H₂O가 들어 있는 튜브에 1 μg의 RNA를 첨가하여 부피가 10 μL에 도달할 때까지 투여합니다. 42 °C에서 2분간 배양합니다.
      2. 마지막 단계에서 반응액에 마스터 믹스 10 μL(RT 효소 믹스 I 1 μL, RT 프라이머 믹스 1 μL , 5x 버퍼 2 4 μL , RNase 프리_H2O 4 μL 4 μL)을 반응액에 첨가한 후 부드럽게 혼합합니다. 즉시 RT 반응을 진행하세요: 37 °C에서 15분, 그 후 85 °C에서 5초.
      3. SYBR RT-qPCR 키트를 사용한 실시간 PCR 기계를 사용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 분석을 수행합니다. 2x 효소 10 μL, 순방향 프라이머 0.8 μL, 역방향 프라이머 0.8 μL, 50x ROX 참조 염료 II 0.4 μL, cDNA 주형 2 μL, RNase 프리 H₂O를 추가하여 총 부피 20 μL가 됩니다.
      4. 각 샘플을 다음 열 매개변수에 따라 3회로 분석하세요: 94 °C에서 30초, 95 °C에서 5초씩 40회, 60 °C에서 34초, 최종 단계는 95 °C에서 15초, 60 °C에서 1분, 95 °C에서 15초입니다. RT-qPCR 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다. 내부 대조군으로 하우스키핑 유전자 B2m 과 18s rRNA 가 사용되었습니다.
   3. ^2-ΔΔCt 방법을 기반으로 상대 접힘 변화를 계산합니다.

표 1: RT-qPCR 프라이머.

입문 이름	시퀀스 (5'-3')	유전자 심볼
IL-6 전방	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	IL6
IL-6 후면	CTCCGACTTGTGAAGTGTTATAG	IL6
TLR2 앞쪽	카카타트카그트카타트	TLR2
TLR2 뒷면	GGAAGACCTTGTGTTCTAC	TLR2
CCL2 전방	CTCACCTGTGTGTGTCTACTCATTC	Ccl2
CCL2 뒷면	ACTACAGCTTCTTTGGGACACC	Ccl2
TNF-α 포워드	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCTCT	TNF
TNF-α 역방향	귄갲꺅췅찹	TNF
β2m 앞으로	GGTCTTTCTGGTGTGTGTGTCT	B2m
β2m 역방향	TATGTTCGGCTTCCCATCTC	B2m
18초 앞쪽	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18의 역방향	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
토드 휴잇 브로스 (THB)	벡턴, 디킨슨 앤 컴퍼니	DF0492078	가루 30g을 정제수 1L에 녹입니다. 121°에서 15분간 오토클레이브를 사용했습니다.
아가르	DSBIO	16C0050	가루 15g을 THB 1L에 녹입니다. 121°에서 15분간 오토클레이브를 사용했습니다.
밀리-Q 기준 정수 시스템	머크 KGaA	Z00QSVCUS	Dnase/RNASE가 없으면
나클	톈진 케미우 화학 시약 주식회사	10019318
Na₂HPO₄	시룡 사이언티브 유한회사	9009012-01-09
KCl	시룡 사이언티브 유한회사	9009017-01-09
KH₂PO₄	시룡 사이언티브 유한회사	9009019-01-09
코	시룡 사이언티브 유한회사	9009014-01-09
글리세롤	시온팜 화학 시약 주식회사	10010618	정제된 물과 같은 부피로 희석한 후 121°에서 15분간 오토클레이브를 사용한다
4% 파라포름알데히드	시온팜 화학 시약 주식회사	80096675
25% 글루타알데히드	시온팜 화학 시약 주식회사	30092436	고정을 위해 정제된 물로 10배 희석한 것입니다.
에탄올	시온팜 화학 시약 주식회사	10009218
클로로포름	시온팜 화학 시약 주식회사	10006818
각광도계	드노빅스 주식회사	DS-11+
초음파 세포 분쇄기	닝보 과학 생명공학 유한회사	JY96-IIN
원심분리기	히타치 코키 주식회사	CT15RE
냉장고	아우크마 주식회사	DW-86L500
FastRNA 프로 그린 키트	MP 생의학	#6045-050
FastPrep-24 기기	MP 생의학	116005500
PCR 기기	센소퀘스트 GmbH	1124310110
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