마우스 모델에서 폐 감염을 위한 마이코박테리움 결핵 의 에어로졸 전달

초록

출처: Mueller, A. 외. 결핵균과 Plasmodium berghei의 자연 전파에 따른 결핵-말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델. J. Vis. 경험 (2014)

이 영상은 네뷸라이저 기반 챔버 시스템을 이용해 마이 코박테리움 결핵(Mtb) 을 생쥐에 에어로졸 전달하여 폐 감염을 유도하는 과정을 시연하며, 생체 내에서 공기 중 결핵 전파와 숙주-병원체 상호작용을 연구할 수 있는 통제되고 재현 가능한 모델을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 글라스콜 에어로졸 챔버를 이용한 Mtb 생쥐 에어로졸 감염

Mtb(결핵균)로 실험 동물의 에어로졸 감염을 표준화하는 가장 좋은 방법은 냉동 육체에서 발견된 CFU(집단 형성 단위) 역가를 가진 마이코박테리아를 사용하는 것입니다. 가축 배양을 준비하기 위해, Middlebrook 7H9 육수에 OADC(올레산, 알부민, 덱스트로스, 카탈라제) 농축 배지와 0.05% Tween 80(마이코박테리아의 탄소원)을 첨가하여 동시에 배양하고, 박테리아 응집 방지 조치를 취합니다. 배양 시 광학 밀도(OD)는 수확 시 ≤ 1이어야 합니다. 높은 OD에서는 박테리아 ��집이 증가하고 생존 가능성이 감소합니다. 1ml 알리코트를 -80 °C에 보관합니다. 7H11 한천 플레이트에 3개의 독립 바이알을 10배 희석하여 0.5% 글리세롤, 1 g/L 아스파라진, OADC를 보충하여 37 °C에서 4주간 배양 후 콜로니를 열거하여 냉동 육지 내 생존 가능한 CFU 수를 결정합니다. 아래에 설명된 대로 에어로졸 감염을 수행합니다.

1. Thaw Mtb 는 알려진 CFU 역가를 비축하고, 27G 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용해 세균 덩어리를 분산시키기 위해 현탁액을 다섯 번 조심스럽게 섞습니다. 에어로졸 생성은 피하세요.
2. 원하는 감염 용량에 따라, 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 50ml 튜브에 필요한 양의 균세균 육즙을 옮깁니다. 최종 용량은 6ml입니다.

참고: 이 현탁액 내 미생물 수를 조절하면 에어로졸 방울을 가진 박테리아의 비율이 달라집니다. 보통 폐당 100개의 생존 가능한 박테리아(저용량 감염)를 목표로 합니다. 저희 경험상, 총 6ml의 부피 중 약 1-2×^{10 Mtb} /ml가 필요하며, 그중 5.5ml가 네뷸라이즈됩니다. 감염에 이상적인 조건을 찾기 위해 다양한 박테리아 농도의 실험용 에어로졸 챌린지를 여러 번 시도하는 것이 권장됩니다. 최대 5,000마리의 마이코박테리아가 포함된 고용량 감염은 감염 과정을 가속화할 수 있지만, 에어로졸로 쥐를 성공적으로 감염시키는 데는 5마리의 박테리아만으로도 충분합니다. 감염률은 보통 100%입니다.

3. 접종 역가를 결정하기 위해 최종 부피보다 더 많은 부피를 제거하고; 보통 500μl을 제거해 기술적 삼중판을 도판합니다.
4. 동물들을 원형 에어로졸 챔버 안에 칸막이 메시 바구니(한 개의 바구니에 쥐 한 마리)에 넣고 에어로졸 챔버 뚜껑을 닫습니다.

참고: 다른 모델들은 파이 모양의 바구니를 갖추고 있으며, 각 칸마다 20마리의 쥐를 수용할 수 있습니다.

5. 벤투리 네뷸라이저 유닛을 세 개의 스테인리스 스틸 소켓 조인트에 부착하세요.
6. 18G 무딘 바늘이 장착된 10ml 주사기로 50ml 튜브에서 마이코박테리아 현탁액을 제거하고, 주사기를 밀폐된 운반 상자에 넣어 에어로졸 챔버로 옮깁니다.
7. 네뷸라이저 장치의 나사 캡을 제거하고 균류균 현탁액을 조심스럽게 네뷸라이저에 주입하세요. 에어로졸 생성을 피하세요. 주사기를 2% 부라톤이 들어간 샤프스 용기에 버리세요. 나사 캡으로 네뷸라이저를 밀봉하세요.
8. 주 전원 스위치와 UV 램프를 켜세요. 제어 키패드 디스플레이에는 "Glas-Col Apparatus Co"가 표시되어 있습니다.
9. 프로그램 스위치를 켜. 디스플레이에는 "네뷸라이저 준비되었나요?" "바구니가 적재되었나요?" 준비가 되면 엔터를 누르세요"라는 메시지가 표시됩니다. 엔터 버튼을 누르세요.
10. 디스플레이에는 "예열 시간 900 진입"이 표시되어 있습니다; 즉, 배기 공기를 오염시키는 소각로의 예열 시간은 900초입니다. 엔터 키를 누르세요.
11. 디스플레이에는 "네뷸라이징 시간 1,800 입력"이 표시됩니다; 즉, 네뷸라이징 시간은 기본값으로 1,800초로 설정되어 있습니다. 네뷸리팅 시간을 연장하려면 "2,400"을 입력하고 엔터를 누르세요.

참고: 네뷸라이징 사이클 동안 압력 하에 공기가 현탁을 분화하여 마이코박테리아가 포함된 작은 에어로졸 방울을 생성합니다. 주 공기 흐름과 함께 약 2-5 μm 크기의 이 물방울들이 에어로졸 챔버로 이동합니다.

 

12. 디스플레이에는 "Enter C.D. Time 1,800"이 표시됩니다; 즉, 붕괴 주기는 1,800초가 걸립니다. "2,400"으로 설정하고 엔터를 누르세요.

참고: 이 주기 동안 네뷸라이징 주기 동안 에어로졸 챔버에 쌓인 구름이 붕괴할 수 있습니다. 작은 물방울들은 실험 동물들이 흡입합니다.

13. 디스플레이에는 "Enter Dec Time 900"이 표시됩니다; 즉, UV 조명 제염 사이클은 900초가 걸립니다. 엔터를 누르세요. 기계는 예열, 네뷸라이징, 구름 붕괴, 자외선 제염 과정을 순환 처리합니다.
    주의: 진공 유량계는 60 입방피트/시간(예열 사이클 시작 시점 확인; 필요 시 진공 제어 밸브 조정)을 표시하고, 압축 공기 유량계는 10 입방피트/시간(네뷸라이징 사이클 시작 시 확인; 공기 제어 밸브 조정)를 표시해야 합니다.
14. 사이클이 완료되면 키패드에 "프로세스 완료 – 시료 제거"가 표시됩니다. 프로그램, UV, 메인 전원 스위치를 끄세요.
15. 마이코박테리아 현탁액이 완전히 네뷸리화되었는지 확인하고, 그렇지 않으면 18G 무딘 바늘이 장착된 적절한 주사기로 조심스럽게 부유액을 제거하여 남은 양을 기록하세요. 남은 부피는 1ml를 넘지 않아야 합니다.
16. 관절에서 네뷸라이저를 제거하고, 2% 부라톤이 들어간 팬에 최소 2시간 동안 보관하세요. 보통 소독은 O/N 방식으로 합니다. 그 후 네뷸라이저를 새 팬으로 옮기고 물로 꼼꼼히 헹군 후 네뷸라이저를 자연 건조시키세요.
17. 에어로졸 챔버를 열고 동물들을 우리에 다시 넣으세요. 바구니는 오토클레이브 백과 오토클레이브에 담아 보관하세요. 에어로졸 챔버 내부 표면을 2% 부라톤으로 닦아주세요.

참고: 안전상의 이유로 이 시술 중에는 전동 공기 정화 호흡기를 착용해야 합니다.

18. 남은 500μl의 균세균 현탁액(1.3단계 참조)을 사용해 7H11 한천 판에 기술적 삼중산액(3 x 100 μl)을 10배 희석하여 판을 부착합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
부라톤	슐케		활성 성분: 알데히드 (포름알데히드, 글루타알데히드, 옥살알데히드, 에틸헥산)
미들브룩 7H9	시그마	M0178	MTB 육수 배양에 대해서는
미들브룩 7H11	BD 생명과학	283810	MTB 배양용 아가르 배지
미들브룩 OADC 농축 매체	BD 생명과학	212240	7H9와 7H11에 Mtb 문화를 추가하세요
흡입 노출 시스템	글라스-콜
네뷸라이저-벤투리	글라스-콜