쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

초록

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).

이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 박테리아의 준비 및 증식

1. 연구자의 기관 생물안전 위원회 및 동물 이용 위원회 지침에 따라 P. aeruginosa 와 동물에 대한 모든 연구는 BSL-2 예방 조치를 준수합니다. 여기서 설명된 P . aeruginosa와 관련된 모든 절차를 생물안전 캐비닛에서 쥐 접종을 포함해 수행하세요.
2. 발광하는 P. aeruginosa 의 PAO1:lux 균주는 요청 시 저희 연구실에서 제공됩니다. 얼린 글리세롤 육수로 저장된 PAO1 스트릭이 라이소젠 브로스(LB) 한천에 보관됩니다. 발광 PAO1:lux 균주에 대해, LB 한천에는 선택적 항생제(100 μg/mL 카르베니실린 및 12.5 μg/mL 카나마이신)가 포함되어야 합니다. 박테리아 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 키우세요.
3. 격리된 군체를 골라 37°C, 3ml LB 배지, pH 7.4에서 하룻밤 동안 키웁니다. 발광 균주의 경우, 육수에는 100 μg/mL 카르베니실린이 포함되어야 합니다. 흔들리는 유산소 조건에서 성장하세요.

2. 절차 준비

1. 수술을 시행하는 모든 인원은 깨끗한 가운/실험복, 마스크, 헤어넷, 장갑을 착용하세요.
2. 가위와 겸자를 포함한 모든 외과 도구에 오토클레이브를 사용하세요. 동물 간 도구를 멸균할 때는 무균 기법을 사용하세요.
3. 수술대를 에탄올로 청소하고 깨끗한 수술장을 준비하세요.

3. 제모

1. 8–12주 된 C57BL/6J 마우스를 1%–3% 이소플루란으로 마취합니다. 연구자들은 아이소플루란 사용 시 기관의 수의사 마취 지침을 따라야 합니다.
   1. 마취를 시작하면 1%–3% 이소플루란을 투여하고 산소 유량을 1.5 L/min으로 조절합니다. 마우스를 유도실에 넣으세요.
   2. 마취 깊이를 확인하기 위해 쥐의 발가락을 꼬집는다. 쥐가 더 이상 자극에 반응하지 않으면, 유도실에서 꺼내 수술대에 올려놓고 코를 이소플루란 코 콘에 넣으세요.
   3. 양쪽 눈에 안구 윤활제를 바르세요.
2. 마우스의 무게를 재서 시술 전 기준 체중을 얻으세요.
3. 마우스를 엎드린 자세로 놓으세요. 양측 옆구리에 250 μL씩 미리 가열된 멸균 0.9% 염화나트륨을 피하 주입하여 총 500 μL를 투여합니다.
4. 전기 면도기를 사용해 쥐의 등쪽을 면도하세요. 상처의 모발 오염을 방지하기 위해 면도는 수술 부위와 다른 장소에서 이루어져야 합니다.
5. 제모 로션을 얇게 바르세요. 로션을 20초에서 60초 정도 두세요. 따뜻한 물에 적신 거즈로 털과 과잉 로션을 제거하세요. 제모 후에는 절제 상처 수술로 진행하세요.

4. 전층 절제 상처 수술

1. 쥐의 중간 등쪽 부위에 25G 바늘을 사용해 0.6–1 mg/kg의 지속 방출형 부프레노르핀을 피하 주사합니다. 서방형 부프레노르핀은 48–72시간 동안 통증 완화를 제공합니다.
2. 수술 부위를 소독하세요. 멸균된 베타딘 면으로 등쪽을 닦으세요. 남은 베타딘은 멸균 알코올 면봉으로 닦아내세요. 이 검사는 베타딘과 알코올을 번갈아 사용하며 3회 시행해야 하며, 중심에서 가장자리까지 원을 그리며 면봉을 채취해야 합니다. 그 부위를 자연 건조시키세요.
3. 멸균 거즈나 플라스틱 랩을 사용해 수술 부위를 둘러싸는 드레이프를 만드세요.
4. 피부를 당기고 당기세요. 멸균된 6mm 직경의 피부 생검 펀치를 사용해 왼쪽 등쪽 표피를 관통하여 초기 절개를 하세요. 오른쪽 등쪽 표피에서도 반복합니다.
5. 왼쪽 윤곽 상처 부위 중앙에서 피부를 텐트처럼 펴는 겸자를 사용하세요. 가위로 표피와 피부층을 절제하세요. 오른쪽에 윤곽이 표시된 상처 부위를 반복하여 대칭적인 절제 상처를 만듭니다.
6. 상처는 멸균 식염수 50 μL로 세척하세요. 수술 부위와 주변 피부를 자연 건조시키세요. 그 후 상처와 등쪽을 투명 필름 드레싱으로 덮으세요.
7. 쥐를 깨끗한 우리에 다시 넣으세요. 한 우리마다 동물 한 마리를 키우세요.
8. 케이지를 온열 패드 위에 올려놓고 쥐가 깨어날 때까지 모니터링하세요.
9. 위 수술을 여러 동물에게 시행할 때는 뜨거운 비드 소독기를 사용해 동물 간 모든 수술 기구를 청소하세요.
10. 쥐가 수술 후 회복하고 상처 위에 임시 상처 매트릭스가 형성될 때까지 24시간을 두고, 이후 박테리아 접종을 진행하세요.

5. P. aeruginosa 접종

1. 100 μg/mL 카르베니실린이 포함된 LB 배지 75 mL에 PAO1:lux 배양물을 OD600 = 0.05로 희석하고, 배양액이 초기 지수적 단계(OD₆₀₀ ≈ 0.3)에 도달할 때까지 박테리아를 배양합니다. 이 과정은 약 2–3시간이 걸릴 것입니다.
2. PAO1을 희석: PBS에 럭스를 넣어 (7.5 ± 2.5) x 10² CFU/mL 농도로 만듭니다. 충분한 부피를 확보하고 실험 후 도금할 수 있도록 과잉 접종량을 반드시 준비하세요. 시설 간 운반(즉, 실험실에서 비바리움까지)을 운반할 때는 생물학적 위험(Biohazard)이라고 명확히 표시된 누수 방지 상자에 이중 격리를 사용하세요.
3. P . aeruginosa 와 쥐를 대상으로 동물 생물안전 등급 2(ABSL-2) 승인 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에서 승인된 개인 보호 장비를 사용하여 수행하십시오. 재사용 가능한 장비, 예를 들어 체중계는 오염을 방지하기 위해 랩으로 덮어야 합니다.
4. 위에서 설명한 3% 이소플루란으로 마취하세요. 마우스 무게를 재고 무게를 기록하세요. 양측 옆구리에 250 μL씩 미리 가열된 멸균 0.9% 염화나트륨을 피하 주입하여 총 500 μL를 투여합니다.
5. 만약 쥐의 투명 필름 드레싱이 하룻밤 사이에 벗겨졌다면, 생긴 딱지를 조심스럽게 제거하고 새 드레싱을 덧발라.
6. 500 μL 투베르쿨린 27G 안전 캡 주사기를 사용해 투명 필름 드레싱을 통해 각 상처에 PAO1:lux 현탁액 40 μL을 주입합니다. 반대쪽에서 교차 오염을 방지하기 위해 비접종/PBS 상처 대조제에는 다른 쥐를 사용해야 합니다.
7. 마우스를 다시 케이지에 넣고 온열 패드 위에 올려놓고 켜보세요. 모든 쥐는 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 우리에 개별적으로 보관해야 합니다.
8. 우리 바닥에 음식 펠릿 사이에 끼워 고칼로리 영양 보충제를 준비하세요.
9. 남은 접종체를 사용해 LB 한천 플레이트에 스트레이크하세요. 투여된 박테리아 수를 확인하기 위해 집락을 세세요.

6. 감염된 상처의 생체 내 영상

1. 생쥐를 영상 기기로 이동시키거나 이동할 때 BSL-2 격리 프로토콜을 따르며, 보조 용기를 사용하세요. 생쥐를 유도실이나 영상 기기로 옮길 때 동물 침구를 옮기거나 떨어뜨리지 않도록 주의하세요.
2. 유도 챔버에서 1% – 3% 이소플루란을 흡입하여 쥐에게 마취를 유도합니다.
3. 쥐가 마취된 후에는 광학 영상 시스템의 영상 챔버에 엎드린 자세로 눕히고, 코를 이소플루란 코 콘에 넣습니다.
4. 소프트웨어 프로그램을 열어보세요.
5. 획득 매개변수는 동시에 촬영된 동물 수와 생물발광 강도에 따라 달라집니다. 기본 설정에는 노출 시간, 비닝, 조리각, 시야각(FOV)이 포함됩니다. 기본 시작 설정은 노출 시간 30초, 저비닝 2초, f/스톱 1.2, FOV 25입니다. 연구자의 필요에 따라 이 설정들을 조정하세요.
6. 영상 프로그램을 사용해 발광 데이터를 분석합니다. 루미네센스는 쥐의 컬러 사진 위에 의사 컬러 이미지로 표현됩니다.
   1. 상처 부위에 관심 영역(ROI)을 생성하고 검출된 평균 플럭스(광자/초)를 측정합니다. 데이터는 복사도(광자/초/cm²/스테라디안)로도 보고할 수 있으나, 영상 플랫폼과 카메라의 거리가 일정하면 플럭스가 충분합니다.
   2. 이미징 플랫폼의 임의의 영역에서 ROI를 생성하여 배경을 측정하세요. 초당 배경 광자 수를 빼면 됩니다.
   3. 데이터를 스프레드시트로 내보내서 추가 분석을 하세요.
7. 감염 진행 상황을 추적하기 위해 위에서 설명한 영상 검사를 매일 반복하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.9% 염화나트륨 주입	호스피라	2484457
18G x 멸균 바늘 1개	BD	305195
25 G x 멸균 바늘 1 1/5	BD	305127
알코올 면봉 검사	BD	326895
오라 이미징 소프트웨어	스펙트럼 기기 이미징	해당 없음
베타딘	퍼듀 프레더릭 컴퍼니	19-065534
부프레노르핀 SR 실험실	주팜	해당 없음
C57BL/6J 수컷 마우스	잭슨 연구소	664
일회용 생검 펀치, 6mm	인테그라	33-36
파인 가위 - 텅스텐 카바이드	파인 사이언스 툴즈	14568-09
유리 구슬 건식 살균기	하버드 장치	61-0183
알갱 한천	피셔 바이오리시약	BP9744
온열 패드	밀리어드	804879481218
28G 바늘이 달린 인슐린 주사기	BD	329461
라고 X 영상 시스템	스펙트럼 기기 이미징	해당 없음
LB 육수	피셔 바이오리시약	BP1426
르-록 1mL 주사기	BD	309628
미니 아르코 애니얼 트리머	발 프로페셔널	919152
Nair 제모 로션에 베이비 오일 포함	처치와 드와이트	해당 없음	어느 약국에서든 구할 수 있습니다
팔각형 겸자	파인 사이언스 툴즈	11041-08
페트리 접시	팔콘	351029
인산염 완충식염수(PBS) 1회	코닝	21-040-CV
프레스 및 밀봉 랩	다행이네요	해당 없음
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세이프티글라이드 인슐린 주사기, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
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