성체 모기에서 정의된 장내 세균 집단 확립

초록

출처: Liu, X. 외. 항생제 처리된 모기를 이용한 박테리아 경구 먹이 검사. J. Vis. 경험 (2020)

이 영상은 항생제 함유 자당 용액을 사용해 모기에서 토종 장내 미생물군이 고갈되는 과정을 보여줍니다. 이후 막 영양 시스템을 통해 박테리아 현탁물을 투여하여 모기 장 내에 정의된 박테리아 집단을 확립하는 통제된 재정착이 이루어집니다.

프로토콜

1. 항생제 치료 및 박테리아 재유입

1. 항생제 용액을 준비하세요.
   1. 10% 자당 용액을 준비하기 위해 필요한 자당, 페니실린, 스트렙토마이신 양을 계량하여 20단위의 페니실린과 20 μg의 스트렙토마이신을 포함합니다.
2. 모기에게 항생제 용액을 먹이세요.
   1. 모기를 4°C에서 3–5분간 진취하세요. 모기를 종이컵에 옮기세요. 모기가 도망가지 못하도록 거즈를 덮고 테이프로 감싸세요.
   2. 멸균된 면봉을 항생제 용액에 담가 모기 컵 위에 조심스럽게 올려놓으세요. 사용 전에 모기가 빠지는 솜뭉치에 빠지지 않도록 꼭 짜주세요.
   3. 수분 증발을 막기 위해 10cm 크기의 페트리 접시로 면봉을 덮으세요. 면봉은 하루 두 번 3일 연속으로 교체하세요.
3. 박테리아 현탁액 준비
4. 분광광도계로 박테리아 용액을 측정하세요. 1 mL 튜브에 1 OD(OD₆₀₀₀) 박테리아 현탁액을 추가합니다. 현탁액을 5,000 x g에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
5. 상원액은 버리고 1.5mL 튜브에 멸균된 1x PBS 완충액 1mL를 첨가하여 현탁액 침전을 수행합니다.
6. 5,000 x g 원심분리기, 4 °C에서 5분간 가동; 상정액을 버리세요.
7. 2.4.2와 2.4.3 단계를 반복합니다.
8. 박테리아 침전액에 멸균 1x 인산염 완충제(PBS) 완충제 200 μL을 첨가합니다.
9. 10% 자당 용액 600 μL, 식각 자극제 역할을 하는 10 mm 아데노신 5′-삼인산(ATP) 200 μL, 그리고 박테리아 현탁액 200 μL을 멸균 1.5 mL 튜브에 첨가합니다. 소용돌이로 섞어.
10. 박테리아 현탁액을 모기에 먹이로 주세요.
    1. 모기를 24시간 동안 굶겨 항생제가 대사할 수 있도록 한 후 박테리아에게 먹이를 주세요.
    2. 막 공급 시스템을 조립하세요.
    3. 멸균된 급식 유닛을 파라필름 또는 콜라겐 막으로 밀봉하세요.
    4. 플라스틱 링을 끼우고 파라필름으로 고정해 급식 중 마찰로 깨지지 않도록 하세요.
    5. 준비된 박테리아 용액을 천천히 먹이통에 넣습니다.
       참고: 2웰 피더 유닛 중 한 웰만 용액으로 채울 수 있으며, 피더 유닛은 시약 투하 쪽에서만 덮습니다.
    6. 먹이 장치를 37°C로 예열된 먹이 시스템에 연결하여, 모기를 유인하기 위해 인간의 체온을 시뮬레이션합니다. 먹이 주기 도구를 모기가 든 종이컵에 올려놓고 90분간 먹이를 줍니다.
    7. 먹이 후 모기를 4°C의 온도에 3–5분간 마취시키고, 얼음 같은 페트리 접시에 마취 상태로 보관하세요.
    8. 완전히 부풀어 오른 모기를 골라 추가 연구를 하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아데노신 5′-삼인산 디나트륨 하이드레이트	시그마	A2383	아데노신 5′-삼인산 이나트륨 염화물 하이드레이트는 아데노신 삼인산(ATP) 표준 용액 제조에 사용되었습니다
헤모텍 막 공급 시스템	헤모텍		헤모텍 온도 조절기, 급연료 하우징 조립체, 금속 급연료 조립 등 급식 시스템 구성 요소들.
파라필름	상곤 바이오텍	F104002	4인치 x 125피트
페트리 접시	상곤 바이오텍	F611203
페니실린 G 프로카인 소금 하이드레이트	상곤 바이오텍	A606248	하얀 가루. 물에 용해되고, 메탄올에 용해되며, 약간 물에 녹아, 에탄올에 녹아요
스트렙토마이신 황산염	상곤 바이오텍	A610494	스트렙토마이신 설페이트는 원핵생물 단백질 합성을 방해하는 글루코사민 항생제입니다.
자당	상곤 바이오텍	A502792	물, 에탄올, 메탄올에 용해되며, 글리세롤과 피리딘에는 약간 용해됩니다.
10배 PBS 버퍼	상곤 바이오텍	E607016	이 제품은 10배 해결책입니다. 사용 전에 10번 희석해 주세요. pH 수치는 7.4입니다.