제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 사사의 실시간 영상

초록

출처: Niu, L. 외. 제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 용해세포 사멸을 생체 내 현미경을 통해 시각화합니다. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 마이코박테리움 마리눔 감염 후 제브라피시 배아에서 대식세포 용해세포 사멸을 시각화하기 위해 생체 내 공초점 현미경을 사용해 보여줍니다.

프로토콜

1. 감염의 실시간 영상 촬영

1. 1. 라이브 이미징을 위한 피시 마운트
   1. 최대 10개의 트리카인 마취 배아를 유리 바닥 35mm 접시 중앙에 이식합니다. 여분의 E3 미디엄은 버리세요.
   2. 접시에 1% 저녹도 아가로스를 덮고, 10G 바늘로 제브라피시 배아를 조심스럽게 방향을 잡으세요. 유리 바닥 접시를 얼음 위에 10초간 부양시켜 아가로스를 굳히세요.
      참고: 중뇌 주입의 경우, 배아는 머리가 위쪽을 향한 상태로 아가로스에 장착되어야 합니다(그림 1A).
   3. 완전히 굳으면 계란 물(그리고 트리카인 1개, PTU(N-페닐티오레아))을 한 겹 덮으세요.
2. 3색 고해상도 타임랩스 공초점 현미경
   참고: 다음 단계는 63.0x 1.40 오일 UV 대물렌즈를 장착한 공초점 현미경에서 수행됩니다.
   1. 환경 챔버의 온도를 28.5 °C로 설정하세요. 챔버 안에 습한 티슈를 넣어 습기를 제공하고 계란 물의 증발을 방지하세요.
   2. 35mm 유리 바닥 접시를 제브라피시와 함께 환경 챔버에 놓으세요.
   3. 공초점 소프트웨어를 열고 단계를 초기화하세요. 63.0 x 1.40 오일 UV 대물렌즈로 전환하고, 밝은 필드 채널과 차등 간섭 대비(DIC) 필터를 사용해 제브라피시를 위치시키세요.
   4. 405 다이오드, 아르곤(20% 파워), DPSS 561 nm 레이저를 열어보세요. 적절한 레이저 출력과 스펙트럼 설정을 설정하세요.
      참고: 다음은 Cerulean(여기 = 405 nm; 방출 = ~456–499 nm), eGFP(여기 = 488 nm; 방출 = ~500–550 nm), DsRed2(여기 = 561 nm; 방출 = ~575–645 nm)의 스펙트럼 설정입니다.
   5. "XYZ"의 "순차 스캔" 획득 모드를 선택하고 이미지 포맷을 "512 x 512 픽셀"로 설정하세요.
   6. "라이브 데이터 모드"로 전환하세요. 첫 번째 제브라피시 위치를 목표로 하여 "시작"과 "끝" Z 위치를 표시하세요. 이 과정을 남은 배아마다 반복합니다. 프로그램 끝에 "일시정지"를 추가할 수 있습니다.
   7. 프로그램의 루프와 사이클을 정의하세요.
   8. 파일을 저장하세요.

결과

그림 1: 라이브 이미징을 위해 제브라피시 배아를 장착하는 모습. (A) 중뇌 감염을 위해 제브라피시 배아는 머리를 아래로 향하게 하여 장착했다. (B) 줄기 부위 감염을 위해 제브라피시 배아는 유리 바닥 접시 바닥 근처에 삽입하여 측면으로 장착했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유리 바닥 35mm 접시	시험관 내 과학	D35-10-0-N
아가로스	상곤 바이오텍	A60015
공초점 현미경	라이카	TCS SP5 II
환경실	페콘	온도 조절 37-2 디지털
마이코박테리움 마리눔			ATCC BAA-535
N-페닐티오우레아 (PTU)	시그마	P7629