신생아 쥐 비장 식세포에 의한 박테리아 사살의 시험관 평가

초록

출처: 세만, B. G., et.al. 그람 음성 세균 패혈증의 신생아 영상 모델. J. Vis. 경험 (2020)

이 영상은 신생아 쥐 비장에서 호중구와 염증성 단핵구를 분리하여 발광 박테리아 살해 분석법에 적용하는 과정을 보여줍니다. 기계적 해리, 적혈구 용해, 자기 구슬 기반 세포 농축, 박테리아 배양, 항생제 보호를 포함합니다. 시간 측정된 발광 측정은 초기 박테리아 내화와 면역 매개 제거를 나타냅니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 심사 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 시험관 내 박테리아 살해 분석법

1. 감염되지 않은 신생아 새끼의 비장을 제거하여 멸균된 60mm 페트리 접시 안에 40 μm 나일론 바구니에 넣으세요. 이 과정을 반복하면 비장을 한 관에 모아 함께 채취하고 균질화할 수 있습니다.
2. 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보충한 인산염 완충 식염수(PBS) 5mL를 추가합니다.
3. 멸균된 3mL 주사기 플런저를 사용해 조직을 분해하여 단일 세포 현탁액이 생성되도록 합니다.
4. 나일론 바스켓 밖에 단일 세포 현탁액을 모아 15mL 원심분리관에 옮긴 뒤, 350 x g 에서 5분간 펠릿 세포를 넣으세요.
5. 세포를 적혈구 용해 완충제(최대 7-8개의 비장에 2mL)에 부탁한 후 상온에서 5분간 방치하여 적혈구를 제거합니다.
6. 비장을 위와 같이 PBS와 펠릿으로 세척하세요.
7. 비장세포를 0.25mL PBS에 0.5% BSA와 2 mM EDTA를 보충하여 기대 세포 수량에 부탁합니다.
8. 비장구 수를 혈구계나 적절한 도구를 사용해 세세요.
9. Ly6B.2⁺ (과립구/염증성 단핵구 골수계 집단)를 면역자기 구슬과 함께 분리합니다.
10. Ly6B.2⁺ 세포를 1 x 10⁵ 세포 밀도의 검정 또는 흰색 96웰 플레이트에 0.1 mL DMEM 부피에 시딩하며, 이 부피에는 10% FBS, 2 mM 글루타민, 25 mM HEPES(완전배지)가 포함되어 있습니다.
11. 발광 대장균 을 열거한 후, 최종 부피 0.1 mL에 원하는 감염 다수성(MOI)으로 박테리아 접종체를 준비합니다. 이는 모든 유정에 필요한 것을 공통 MOI에서 일괄 생산하는 것이 가장 좋습니다.
12. 대조군으로 박테리아 접종제 또는 전액 배지를 0.1mL 추가하세요. 멀티웰 플레이트를 37°C, 5%_CO2 에서 1시간 동안 배큐하세요.
13. 피펫으로 부드럽게 배지를 제거하고 새 피펫 팁으로 신선한 배지를 추가하여 겐타마이신이 포함된 신선 완전 배지(100 μg/mL)로 교체합니다. 배양물을 다시 2시간 더 부양 상태로 돌려주세요.
14. 감염 후 3시간 후, 플레이트 리더기를 사용해 뚜껑이 있는 배양판 바닥에서 각 웰의 발광을 측정한 후 배양을 다시 배양 상태로 돌려보냅니다.
15. 다른 원하는 시점에서 발광 측정을 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ACK 용해 버퍼	깁코	LSA1049201	박테리아 제거 분석
안티-Ly-6B.2 마이크로비즈	밀텐이 바이오텍	130-100-781	세포 격리
대장균 O1:K1:H7-lux (루시페라제 발현)	해당 없음	해당 없음	WVU에서 자체 제작
격리 완충	밀텐이 바이오텍	해당 없음	박테리아 제거 분석
LB 브로스, 레녹스	피셔 바이오리시약	BP1427-500	박테리아 증식
EASYstrainer (나일론 바스켓)	그레이너 바이오-원	542 040	셀 스트레이너
스펙트라맥스 iD3	분자 장치	해당 없음	번호판 인식기