동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.
1. 박테리아 접종체 제조
- 트립틱 대두 한천(TSA) 플레이트에 접종 루프를 부착하여 루시페라제를 안정적으로 발현하고 카나마이신 내성을 가진 대장균 O1:K1:H7-lux 냉동 재고에서 단일 군락을 분리하는 트립틱 대두 한천(TSA) 플레이트를 스트릭합니다. 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
- 다음 날, 루리아 육수(LB)를 생물안전 캐비닛에 실온(25°C)으로 두세요.
- 바이오세이프티 캐비닛 후드 아래, 줄무늬 플레이트에서 단일 군락을 식별하여 카나마이신(30 μg/mL)을 보낸 LB 3mL에 접종합니다. 37°C에서 하룻밤 배양하며 분당 220회전(rpm)으로 흔들게 하세요. 이것이 바로 스타터 문화입니다.
- 스타터 배양액을 1:100 크기로 신선한 3mL LB에 희석한 후 생물안전 캐비닛 후드 아래에서 37°C에서 2-3시간 동안 인큐베이터에 넣고 흔들며(220rpm) 보관합니다. 이것이 바로 스톡 문화입니다.
- 분광광도계를 사용하여 600 nm 거리에서 블랭크 및 스톡 배양액의 광 밀도(OD)를 측정합니다. 박테리아가 없는 100 μL의 LB를 96웰 평평한 바닥 검사판의 한 웰에 첨가; 이게 바로 빈 카드입니다. 그 후 스톡 배양액에서 100 μL을 별도의 웰에 추가합니다. 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 흡광도는 플레이트 리더기를 통해 측정됩니다.
- 빈 흡수도를 스톡 배양 흡수 값(OD 값)에서 빼고, 이전에 생성되고 검증된 성장 곡선과 비교하여 감염 용량 준비를 위한 스톡 배양 내 박테리아 밀도를 근사적으로 추정합니다.
- 연구 질문에 따라 표적 접종체를 생성하세요. 본 연구에서는 마우스(/마우스)당 2개의 10⁶(낮음)와 7개의 10⁶(높음) 군락형성 단위(CFU)를 타깃 접종체로 사용했습니다.
- 마우스당 목표 용량(DoseT)을 재고 배양 내 추정 박테리아 농도로 나누어 재고 튜브에서 필요한 박테리아 양(VS)을 구합니다.
- VS에 감염해야 할 쥐 수(NM)와 5-10마리의 추가 양을 곱해 감염에 필요한 총 박테리아 양과 5-10회 추가 용량을 합산합니다. 이 부피를 기본 튜브에서 분리해서 새 원심분리기 튜브에 넣으세요.
- 아래 식을 사용하세요: DoseT/스톡 = VS x NM = 스톡 튜브에서 제거할 박테리아의 총 부피(VT).
- 박테리아를 2,000 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리하고, 감염 대상 쥐 한 마리당 50 μL 인산염 완충 생리식염수(PBS)(pH 7.2-7.6)에 재현탁합니다(예: 2 x 10/0/0 박테리아 10회 투여 시 2 x 10⁷ 박테리아 펠릿은 500 μL PBS에 재현탁). 다시 말하지만, 필요한 것보다 더 많은 접종제를 준비하는 것이 권장됩니다. 대조군 접종을 위해 동일한 양의 PBS를 준비하세요. 감염성 접종과 PBS 방제는 감염 전까지 얼음 보관하세요.
- 96웰 플라스틱 바닥 희석판에서 PBS로 7번 10배 연속 희석을 수행하고, 25 μL의 희석액을 카나마이신(30 μg/mL)을 보충한 사분면 TSA 플레이트에 두 배로 판을 부착하여 실제 투여된 박테리아 양을 계산합니다. 조사 전에 37°C에서 하룻밤 배양하여 군집 형성을 진행하세요.
2. 동물 식별
- 나이에 맞는 새끼들을 동기화할 수 있도록 충분한 번식 쌍을 배치하세요. 1일 ± 나이 차이는 허용됩니다.
- 임신한 C57BL/6 암컷 쥐를 식별하고, 계획된 실험에 앞서 새끼의 출생을 모니터링하여 정확한 나이를 결정합니다.
- 대조군과 감염된 3일 또는 4일 된 새끼를 구분하기 위해, 작고 가늘게 끝이 있는 아이리스 가위를 사용해 대조군 새끼의 꼬리 끝만 잘라내세요. 감염된 새끼들은 꼬리 절단을 받지 않습니다. 꼬리를 자르기 전에 70% 에탄올을 뿌린 솜뭉치로 피부를 소독하세요. 필요에 따라 솜뭉치나 거즈로 꼬리 끝을 압박하세요.
참고: 이 절차는 생물안전 캐비닛 후드 아래에서 수행됩니다. 꼬리 절단 길이는 약 1/8인치 정도면 충분합니다. - 대조군과 감염군 내 새끼를 식별하기 위해, 1mL 인슐린 주사기와 28G x 1/2'' 영구 바늘을 사용해 새끼 꼬리에 문신을 새기세요. 문신하기 전에 70% 에탄올을 적신 솜뭉치로 피부를 소독하세요. 이 절차는 생물안전 캐비닛 후드 아래에서 수행됩니다.
- 꼬리에 문신을 넣으려면, 바늘 끝에 동물 문신 잉크를 바릅니다. 다음으로, 꼬리를 완전히 드러낸 한 손으로 조심스럽게 강아지를 제지합니다. 바늘을 피부 밑에 부드럽게 넣고, 표면적인 깊이를 유지한 뒤, 바늘을 피부와 평행하게 몇 밀리미터 움직여 작은 자국(점)을 만듭니다. 과도한 잉크가 피부 밑에서 빠지지 않도록 몇 초간 기다렸다가 천천히 바늘을 빼세요.
- 필요에 따라 면봉이나 거즈로 상처를 압박하세요. 피부 표면에 남은 과도한 문신 잉크를 70% 에탄올로 제거하세요.
- 감염군과 대조군의 후속 쥐들에게도 이 과정을 반복하며, 새끼가 문신을 할 때마다 점이 하나씩 추가됩니다(예: 새끼 1은 꼬리에 점 1개, 새끼 2는 꼬리에 점 두 개, 등).
참고: 추가적인 식별 차원을 위해, 대조군과 감염군에 대해 동물 문신 잉크를 별도의 색상으로 사용하는 것이 권장됩니다.
3. 견갑하 접종
참고: 본 연구에서는 저용량 그룹과 고용량 그룹이 각각 지정되어 2개의 실험이 수행되었습니다. 첫 번째 실험에서는 7마리의 새끼에게 저용량 접종을 투여했고(대조군으로 4마리), 다른 새끼 중 5마리가 고용량(대조군으로 3마리)을 투여했습니다. 실험 1의 새끼들은 24시간 시점에 대한 데이터만 제공했습니다. 두 번째 실험에서는 8마리의 새끼에게 저용량 접종을 투여했고(2마리는 대조군), 6마리는 고용량 접종(대조군으로 2마리)을 투여했습니다. 실험 2의 새끼들은 0, 10, 24시간 시점에 대한 데이터를 제공했습니다.
- 강아지들은 1일 ≤ 나이에 맞춰야 합니다. 각 새끼를 저용량 또는 고용량 분량으로 나누세요. 새끼 중 새끼를 무작위로 대조군 또는 감염된 강아지로 지정하세요.
- 출생 후 3일차 또는 4일째에는 대장균 또는 PBS 대조군 접종 전 모든 새끼의 체중을 기록하세요. 이 기간 동안 암막과 새끼를 분리하여 감염 중에 새끼가 움직이지 않도록 하세요.
- 인슐린 바늘을 사용해 생물안전 캐비닛 내에서 PBS 또는 대장균 접종체를 흡인합니다. 이 연구에는 마우스당 2 x 10⁶ 및 7 x 10⁶ CFU의 접종체가 사용되었습니다. 감염성 접종과 PBS는 견갑하 주사 투여 전까지 냉동에 보관하세요.
- 신생아를 생물안전 캐비닛 후드 안의 깨끗한 표면 위에 올려놓고, 목덜미 피부를 들어 올려 목덜미를 긁으려 합니다.
- 이제 동물의 피부와 근육 사이에 생긴 공간에 바늘을 삽입하고, 피부 바로 아래에서 경사면을 올린 뒤 50 μL PBS 또는 대장균을 주입합니다. 동시에 눌린 피부 부분을 풀어 주사 역류를 방지하세요.
- 바늘을 천천히 조심스럽게 빼세요. 주사 후 강아지를 다시 댐으로 돌려보내세요. 참고: 발달 단계의 해부학적 특성상, 3-4일째에 꼬리정맥이나 복강내 주사를 신생아 새끼에게 투여하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 따라서 시술이 용이하기 때문에 본 연구에서는 견갑하 감염 경로가 선택되었습니다.
