마우스 치은조직 절편에서 박테리아의 현장 검출

초록

출처: 최, Y. S. 외 16S rRNA를 표적으로 하는 디곡신 표지 DNA 프로브를 이용한 파라핀 내의 박테리아 현장 검출. J. Vis. 경험 (2015).

이 영상은 박테리아 DNA를 표적으로 하는 디곡신 표지 DNA 프로브를 이용해 쥐 치은골 조직 절편에서 박테리아를 현장에서 검출하는 과정을 시연합니다. 이 절편은 탐침과 함께 인큐베이션됩니다. 디곡신에 특이적인 알칼리성 인산효소 결합 항체가 첨가됩니다. 내인성 인산효소는 비활성화되고, 기질 첨가를 통해 색이 있는 침전물이 얻어집니다. 절편은 카운터 스테인, 탈수, 자일렌 제거 후 세균을 현미경으로 시각화하기 전에 부착합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 적절한 동물 윤리 심사 위원회의 검토 및 승인을 받았습니다.

1. 프로브 준비

1. 프로브의 PCR 증폭
   1. 포르피로모나스 치은지발리스 특이적 프로브를 위해, P. gingivalis 16S rRNA의 유전체 DNA와 다음 프라이머를 이용해 PCR을 통해 P. gingivalis 16S rRNA의 343-염소 DNA 조각을 증폭합니다: 5'- TGC AAC TTG CC TAC AGA GG-3' 및 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. 다음 사이클 조건으로 증폭을 수행합니다: 95 °C에서 35회 30초, 60 °C에서 30초, 72 °C에서 1분 20초, 그리고 72 °C에서 5분 연장.
   2. 올리고뉴클레오타이드로 합성된 70염계 DNA 조각(5'-CAGGTGTGTCATGGGTGTCGTCGTCGTGAAATGTGTTAAGCCGCAACGGGCAACCC-3')과 다음과 같은 프라이머를 사용하여 진세균 프로브를 증폭합니다: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' 및 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. 다음 사이클 조건으로 증폭을 수행하세요: 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 1분 20초, 그리고 72°C에서 5분간 연장.
   3. PCR 산물(≥500 μl)을 3M 아세테이트 나트륨(pH 5.2)과 100% 에탄올(10:1:2 비율)을 첨가하여 -20 °C에서 2시간 배양하여 침전시킵니다.
   4. 혼합물을 14,000 x g에서 15분간 원심분리하고, 펠릿을 100μl 트리스-에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 또는 TE 완충제에 재현탁한 뒤, 260 nm 광밀도로 DNA 농도를 측정합니다.
2. DIG DNA 표지 및 검출 키트를 이용한 디곡시제닌(DIG) 표지
   1. 프로브 3 μg을 물과 혼합하여 최종 부피 15 μl로 만듭니다.
   2. DNA를 95°C에서 10분간 변성시키고, 얼음 위에서 빠르게 냉각하세요.
   3. 변성 DNA 15 μl에 10x 헥사뉴클레오타이드 혼합물 2 μl, 디옥시뉴클레오사이드 삼인산(dNTP) 표지 혼합물 2 μl, 클레노우 효소 1 μl 클레노우 효소를 첨가합니다.
   4. 혼합 후 37°C에서 24시간에서 48시간 배양한 후 65°C에서 가열하여 반응을 멈춥니다.
3. DIG DNA 표지 및 검출 키트를 사용해 DIG 표지된 프로브의 감도를 확인하세요
   1. 키트에 제공된 양성 대조 프로브 1μl 연속 희석액과 DIG 라벨 프로브 1 ng를 나일론 막에 수동으로 적재한 후 실온(RT)에서 5분간 건조합니다.
   2. 막을 2개의 식염-시트레이트나트륨(SSC) 완충제(0.3 M 염화나트륨 또는 NaCl, 30 mM 시트레이트 나트륨, pH 7.0)에 잠시 담근 후 80°C에서 1시간 배양하여 DNA를 고정시킵니다.
   3. 막을 말레산 완충제(MAB, 0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl, pH 7.5)에 잠시 담근 후, 키트에 제공된 6ml 차단액에 희석(1:5,000)인 항체를 30분간 적발시킵니다.
   4. 막을 MABT(1% Tween 20 함유 MAB)로 세척한 후, 40 μl 니트로블루 테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴 인산염(NBT/BCIP) 용액과 2ml 검출 완충제(0.1 M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염 또는 트리스-HCl, 0.1 M NaCl, 0.05 M 마그네슘 클로라이드 또는 MgCl₂, pH 9.5)를 멤브레인에 1분간 발포합니다. 라벨링된 프로브의 감도가 만족스럽지 않으면 1.1.3에서 1.3.4까지 단계를 반복합니다.
   5. 표지된 프로브(OD₂₆₀)의 DNA 농도를 측정하고 100 ng μl-1로 조절합니다.
4. DIG 표지된 프로브의 특이성을 확인하세요
   1. 특정 탐침이 표적으로 삼은 박테리아를 포함한 다양한 박테리아 종의 유전체 DNA 샘플(샘플당 25 ng 3 μl-1)을 95 °C에서 10분간 변성시키고 얼음 위에서 빠르게 냉각합니다.
   2. 변성 DNA를 나일론 막에 수동으로 적재하고 RT에서 20분간 건조하세요.
   3. 막을 SSC 완충제 2개에 잠시 담근 후 80°C에서 2시간 배양하여 DNA를 고정하세요.
   4. RT에서 차단액으로 막을 1시간 동안 막을 막으세요.
   5. 하이브리다이제이션 버퍼에서 1 ng μl-1로 프로브를 희석하고, 희석된 프로브를 변성시켜 막에 적용합니다.
   6. 막을 45°C에서 1시간 동안 배양하세요.
   7. 멤브레인을 SSC 버퍼 2개로 세 번 세척하세요.
   8. 멤브레인을 잠시 MAB에 담가둡니다.
   9. 6ml 차단액에 희석된 항-DIG AP 결합 항체를 1:2,000으로 RT에서 1시간 인큐베이팅합니다.
   10. 막을 MABT로 세척한 후 NBT/BCIP 용액 40μl에 2ml 검출 버퍼를 혼합하여 바릅니다.
   11. 프로브가 예상 특이성을 달성하지 못하면 특이성이 관찰될 때까지 하이브리드화 온도를 높입니다.

2. 현장 교배화

참고: 시료와 시약의 건조를 피하기 위해 모든 인큐베이션은 젖은 종이 타월로 감싼 가습 챔버에서 수행하십시오.

1. 조직 절편의 탈파라핀화 및 재수화
   1. 파라핀 내장된 블록으로 두께 4μm 조직 절편을 준비합니다. 포르말린, 파라포름알데히드, 아연 기반 고정제는 이 프로토콜과 호환됩니다.
   2. 모든 시약은 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리된 물로 준비하세요.
   3. 60°C의 건조 오븐에서 30분간 가열한 후, RT에서 30분간 인큐베이팅합니다.
   4. 100% 자일렌에 5분간 세 번 담그세요; 매번 신선한 자일렌을 사용하세요.
      참고: 이 왁싱 제거 과정을 화학 훈기 후드에서 진행하세요.
   5. 슬라이드를 100% 에탄올에 5분간 두 번 담그고, 매번 신선한 에탄올을 사용하고, 시료를 90%, 80%, 70% 에탄올 용액을 연속으로 5분씩 재수화합니다.
   6. 슬라이드를 DEPC 처리된 물에 1분간 담근 후, DEPC 처리된 인산염 완충 식염수 또는 PBS(pH 7.4)에 6분간 세척합니다.
2. 조직 절편의 전처리
   1. 슬라이드를 0.1N 염산에 20분간 담근 후 DEPC 처리된 물에 30초간 세척합니다.
   2. 왁스 펜을 사용해 표본 주위에 소수성 장벽을 그려보세요.
      참고: 소수성 장벽의 크기는 표본의 크기에 따라 달라집니다. 따라서 다음 단계에서 사용되는 시약의 양은 시료 크기에 따라 달라지며, 소수성 장벽(작은 시료는 50 μl, 대형 시료 400 μl)을 채워야 합니다.
   3. 표본을 50에서 400μl 단백질효소 K(DEPC 처리 PBS에 1에서 10 μg ^ml-1 )를 37°C의 건조 오븐에서 30분간 처리하고, DEPC 처리 1x PBS에 세척 슬라이드를 1분간 넣습니다.
   4. DEPC 처리 PBS에 4% 파라포름알데히드에 10분간 슬라이드를 담근 후, DEPC 처리된 PBS에 1분간 세척합니다.
   5. 슬라이드를 0.1M 트리에탄올라민-HCl(pH 8.0)에 0.5% 아세트산 무수화물이 함유된 상태에 20분간 담근 후 DEPC 처리된 물에 30초간 세척합니다.
3. 프로브와 세척과의 하이브리다이제이션
   1. 슬라이드를 2x SSC 버퍼에 20분간 담그세요.
   2. 프로브를 1 ng ^μl-1 용량의 하이브리다이저 버퍼(4x SSC, 50% [볼륨/볼륨] 포름아마이드, 1x 덴하트 용액, 10% [무게/용량] 덱스트란 황산, 0.1% [무게/용량] 도데실 황산나트륨, 0.4 mg ml-1 연어 정자 DNA 사용)에 희석합니다. 음성 대조군의 경우, 표지된 프로브와 표지되지 않은 프로브의 10배 초과량을 혼합하세요.
   3. 희석된 프로브를 변성시키고 50에서 400μl을 조직 절편에 적용합니다. 슬라이드에 덮개를 덮고 매니큐어로 밀봉하세요.
   4. PCR 기계에서 90°C에서 10분간 열을 사용하고, 슬라이드를 45°C 또는 1.4.11단계에서 결정한 최적 온도에서 가습실(O/N)에서 하룻밤 배큐팅합니다.
   5. 슬라이드를 4°C에서 30분간 냉각하고, 커버 슬립을 제거한 후 다음과 같이 시리얼 SSC 버퍼에 담가세요: 4개의 SSC 10분, 사전 예열(45°C) 2개의 SSC 2개(20분), SSC 2개(10분), 0.2개의 SSC 10분.
4. 항DIG AP 결합 항체를 이용한 검출
   1. MABT 슬라이드를 5분간 세척하세요.
   2. 블로킹 용액 50에서 400 μl에 1% 트윈 20을 20분간 블로킹합니다.
   3. 차단액에 희석된 항-DIG-AP 항체를 50에서 400 μl(1:1,000)로 첨가하고 37°C에서 90분간 배양합니다.
   4. MABT 슬라이드를 10분간 세척하세요.
   5. 1% Tween 20이 포함된 검출 버퍼에 슬라이드를 5분간 담그세요.
   6. 1 mM 레바미솔 50에서 400 μl(1% Tween 20 함유 침입 버퍼 내)으로 5분간 내인성 알칼리성 인산파타제를 비활성화합니다.
   7. 각 표본에 50에서 400μl의 미리 혼합된 NBT/BCIP 용액(검출 완충액에 1:100으로 희석)을 분포하고, 습윤 챔버에서 RT 상태로 슬라이드를 2시간에서 3시간 배양하여 현상 신호가 만족스러워질 때까지 보관합니다.
   8. 시야를 멈추기 위해 이온화된 물로 슬라이드를 세척하고, 37°C에서 10분간 0.05% [무게/부피] 메틸 그린 50에서 400μl 메틸 그린을 10분간 반스테인으로 바릅니다.
   9. 슬라이드는 탈이온수로 세척하고, 100% 에탄올에 탈수한 뒤 자일렌에 담가세요.
   10. 각 슬라이드와 커버 슬립에 80μl의 마운팅 용액을 바릅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
무수물 무수물 아세트	시그마	6404
50% 덱스트론 황산염 용액	밀리포어	S4030
50배 덴하르트 해법	시그마	D2532
디에틸 피로카보네이트 (DEPC)	시그마	P159220
디곡시제닌(DIG) DNA 표지 및 검출 키트	로슈	11 093 657 910
포름아마이드	시그마	F9037
임엣지™ 펜	다코	H-400
레바미솔	벡터	SP-5000
염화마그네슘	시그마	246964
말레산	시그마	M0375
메틸 그린	시그마	M6776
파라포름알데히드	시그마	P1648
퍼마운트	피셔	SP15-500
연어 정자 DNA 용액	인비트로젠	#15632-011
염화나트륨	시그마	S9625
시트레이트나트륨	덕산	D1420
도데실 황산나트륨	암레스코	227
트리에탄올라민-HCl	시그마	90279
트리스-HCl	유기물 연구	3098T