생물발광을 이용한 쥐 모델에서 요로 감염의 시각화

초록

출처: Luyts, N. 외. 생체발광 영상을 이용한 요로 감염 및 그 치료에 대한 종단 추적 관찰. J. Vis. 경험 (2021).

이 영상은 방광에 주입된 생물발광성 대장균 을 이용해 쥐 모델에서 요로 감염을 유도하고 추적하는 과정을 시연하며, 박테리아의 부착, 침입, 세포 내 복제가 이루어집니다. 생물발광 오페론에서 방출되는 빛은 감염 진행 중 박테리아 부하를 실시간으로 측정하는 지표 역할을 합니다.

프로토콜

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 접종

1. 동물 준비
   1. 연구 질문과 노크아웃 라인의 가용성, 실험 세부사항, 요로감염 감수성 차이에 따라 원하는 마우스 품종을 선택하세요. 암컷 쥐는 요도 도관 삽입이 더 쉽다는 점을 기억하세요. 8주 미만의 동물은 면역학적으로 미성숙하므로 사용하지 마세요. 여기서는 12주 된 암컷 C57Bl/6J 마우스를 사용했습니다.
   2. 동물들은 미리 주문하고 이상적으로는 7일 정도 적응시키세요. 개별 환기가 되는 우리에 그룹으로 키우며, 표준 12시간 밝고 어두운 조건 하에 있습니다.
   3. 동물의 복부 부위를 밀어 신호 손실을 최소화하세요. 제모 크림은 동물의 피부를 빠르게 데일 수 있으므로 사용하지 마세요. 비우세 손으로 목덜미와 뒷다리를 단단히 잡고 우세 손으로 면도를 하여 동물을 제압하세요. 또는 이소플루란 마취 하에서 면도하세요.
      참고: 동물들은 영상 촬영 2일 전에 면도했는데, 이는 동물들이 면도한 부위를 더 미용할 것이기 때문입니다.
   4. 실험 내내 물과 표준 음식을 자유 롭게 제공하세요. 하지만 주입 2시간 전에는 방광 용량을 최소화하기 위해 물을 차단하세요.
   5. 멸균된 24G 혈관카테터 팁을 100 μL 주사기에 장착하고 박테리아 용액을 주사기에 채웁니다.
      참고: 배경 발광을 결정하기 위해 주입 전에 기준선 이미지를 얻으세요(아래 2단계 참조).
2. 가축 입종
   1. 동물을 유도 챔버에 넣고 순수 산소를 운반 가스로 사용한 이소플루란 흡입(유도 3%, 유지 1.5%)을 통해 마취합니다.
   2. 한 마리의 동물을 작업면에 누운 자세로 눕히고, 주입 중에는 코 콘을 사용해 안정적인 이소플루란 마취를 유지하세요. 눈 연고를 바르세요.
   3. 잔여 소변을 부드럽게 압박하고 치골 상부 부위에 원을 그리며 배출하세요. 주입 전에 70% 에탄올로 하복부를 깨끗이 세척하세요.
   4. 카테터 끝에 생리식염수로 윤활하세요. 비우세 손의 검지로 복부를 올려 부드럽게 위로 밀어 올립니다. 요도에 카테터를 90° 각도(수직)로 시작한 후 저항이 나타나면 수평으로 기울인 후 더 깊이(0.5cm) 삽입합니다.
      참고: 카테터를 억지로 밀지 마세요. 이는 요도에 손상을 줄 수 있습니다. 카테터 삽입 시 부드러운 회전 동작이 도움이 될 수 있습니다. 반면, 저항이 없다면 보통 질에 잘못 삽입되었음을 의미합니다.
   5. 50 μL 박테리아 접종액(2 x 10⁷ CFU)을 천천히 주입합니다(5 μL/s).
      참고: 더 많은 양이나 빠른 주입은 신장에 역류를 일으킬 수 있습니다. 이 기법을 연습하는 동안 파란 잉크를 사용해 역류를 평가할 수 있습니다.
   6. 주입 후에는 주사기와 카테터를 몇 초 더 제자리에 둔 후 천천히 빼서 누출을 막으세요. 많은 누출이나 피가 섞인 요와 같은 불규칙한 부분을 기록하고, 필요하다면 동물은 제외하세요.
   7. 동물을 영상 챔버의 코 원뿔 쪽에 누운 자세로 위치시키고, 나머지 모든 동물에 대해 앞서 1.1.1-1.1.6 단계를 반복합니다. 실험 그룹당 하나의 카테터를 사용하세요. 마취를 계속하고 첫 번째 동물과 마지막 동물 사이의 시간을 최소화하세요.
   8. 필요하다면 영상 촬영 전후(2단계) 항생제나 실험용 약물을 투여하세요. 예를 들어, 엔로플록사신을 투여할 때는 엔로플록사신 40 μL(100 mg/mL) 용액을 생리용 식염수 3.96 mL에 첨가하여 1/100 희석 비율을 얻습니다. 오전 9시와 오후 5시에 100 μL/10 g을 피하 주사하여 하루 두 차례 10 mg/kg의 엔로플록사신을 3일간 투여합니다.

2. 생물발광 영상

1. 영상 매개변수의 준비 및 선택
   1. BLI 획득 소프트웨어(재료표 참조)를 열고 영상 장치(재료표 참조)에서 초기화(Initialize)를 클릭하여 카메라와 스테이지 컨트롤러 시스템을 테스트하고 CCD 카메라를 -90°C로 냉각하세요.
      참고: 이 과정에서 문이 잠기고, 초기화 진행 상황을 제어판에서 확인할 수 있습니다. 초록불은 -90 °C의 온도에 도달했음을 나타냅니다. 초기화 완료 전에 영상 촬영을 시도하면 경고가 표시됩니다.
   2. 데이터가 자동으로 저장되도록 확인: 획득 자동 저장을 클릭하고 올바른 폴더를 선택하세요.
   3. 발광과 사진을 선택하세요. 기본 발광 설정을 확인하세요: 여기 필터를 블록으로, 방출 필터를 열어두세요.
   4. 첫 이미지를 찍을 때, 특히 희미한 신호를 예상할 때는 노출 시간을 자동으로 설정하여 충분한 광자 수를 확보하세요. 생체 내 측정과 밝은 신호를 위해 노출 시간을 ~30초로 설정하세요. 이미지가 채도가 높으면 경고가 표시됩니다. 이럴 경우 노출 시간을 줄이세요.
   5. 중간 빈 설정, F/스톱 1을 선택하고 올바른 시야각(FOV)(5마리 동물 D)을 선택하세요.
   6. 마우스를 촬영할 때 피사체 높이를 1cm로 설정하세요.
   7. 획득 제어판에서 추가를 세 번 클릭하면 기술적 복제 방식대로 세 장의 이미지 시퀀스를 얻을 수 있습니다.
2. 영상
   1. 쥐를 영상 챔버에 누운 자세로 눕히고, 실험 내내 매니폴드 코콘(이소플루란 1.5%)을 사용해 마취를 유지하세요. 최대 5마리의 쥐를 동시에 촬영하고, 반사를 막기 위해 라이트 배플을 사용해 동물들을 분리하세요.
   2. 문을 닫고 Acquire를 클릭하면 영상 시퀀스가 시작됩니다.
   3. 실험에 관한 상세한 정보(야생형 및 기절 동물, 치료법, 촬영 당일 등)를 작성하세요. 노출 시간과 같은 영상 설정은 자동으로 저장됩니다.
   4. 쥐를 영상 챔버에서 꺼내 다시 우리로 돌려놓으세요. 마취 후 완전한 회복 여부를 확인하세요. 몇 분 내에 동물들은 완전히 깨어나 탐색 활동을 시작할 것입니다. 진통제는 요로감염 과정에 방해가 될 수 있으니 제공하지 마세요.
   5. 다음 영상 촬영 주기까지 케이지를 환기 있는 랙에 다시 넣으세요. 실험 완료 후에는_CO-2 질식사 또는 자궁경부 탈구로 동물을 안락사시킵니다. 이소플루란 마취 회복 전에 이 작업을 하여 고통을 최소화하세요

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마취 증기 발생기	하버드 장치 제한	해당 없음	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
베이트릴 100 mg/mL	바이엘	해당 없음	엔로플록사신
BD 인사이트 오토가드 24 GA	BD	382912	노란색 피관관, 삽입할 때는 멸균 플라스틱 팁을 사용하세요
C57Bl/6J 마우스	장비에	해당 없음
원심분리기 5804R	에펜도르프	EP022628146
드롭센스 16	언체인드 랩스	트리네	외경 600nm를 측정하기 위해
둘벡코의 인산염 완충 식염수, 깁코	서모피셔 사이언티픽	참고 14040-083
에탄올 70% 변성 5L	VWR 인터내셔널	85825360
팔콘 14ml 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브, 스냅캡	코닝	352057
팔콘 50ml 셀스타트	그라이너	227285
해밀턴 가스타이트 주사기, PTFE 루어 잠금장치, 100 μL	시그마-올드리치	26203	50 μL의 느린 박테리아 주입을 보장하기 위해
접종 루프	로스	6174.1	홀더: 예술. 번호 6189.1
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