식물 세포에 유전자 전달을 위한 아그로박테리움 배양 준비

초록

출처: Shi, J. 외, 식물 병원체의 분비 효과자로부터 RNA 침묵 억제 물질의 스크리닝 및 식별. J. Vis. 경험 (2020)

이 영상은 아 세 토시린곤으로 병원성 유전자 발현을 유도한 후 세척과 재현탁을 통해 항생제를 제거하여 식물 조직에 유전자 전달을 위한 형질전환 준비 현탁액을 생성하는 과정을 시연합니다.

프로토콜

1. 침투를 위한 아그로박테리움 배양 준비

1. Luria-Bertani(LB) 플레이트에서 양성 콜로니를 선택하고, 50 μg/mL 카나마이신과 50 μg/mL 리팜피신을 보충한 LB 배지가 담긴 유리관에 세포를 접종합니다. 세포를 30°C에서 200rpm에서 흔들며 24−48시간 동안 배양합니다.
2. 100 μL 배양물을 동일한 항생제, 10 mM 2-(N-morpholino) 에탄설폰산(MES; pH 5.6), 20 μM 아세토시린곤(AS)을 보충한 5 mL LB 배지에 옮깁니다. 30°C에서 200rpm에서 16−20시간 동안 진동시키며 박테리아를 배양합니다.
3. 원심분리기 셀을 4,000 x g 에서 10분간 보관하세요. 상정액을 부어내고 10 mM MgCl₂ 완액제 2 mL에 다시 부탁합니다.
4. 항생제를 완전히 제거하기 위해 1.3단계를 반복하세요.
5. 600nm(OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 측정하여 아그로박테리움 배양의 밀도를 결정합니다. OD₆₀₀ 1.5−2.0에 10 mM_MgCl2 버퍼로 조정하세요.
6. 최종 현탁 배양에 10 mM MES(pH 5.6)와 150 μM AS를 추가하고, 세포를 최소 3시간 동안 흔들지 않고 RT에서 배양합니다.
   참고: 최종 현탁 배양 검사를 하룻밤 동안 두지 마세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-모르폴리노에탄설폰산(MES)	바이오프록스	1086GR500	버퍼
아세토시링곤 (AS)	시그마-올드리치	D134406-5G	아그로박테리움의 유도
아가르	시그마-올드리치	A1296-1KG	LB 미디엄
박토 트립톤	BD 생명과학	211705	LB 미디엄
박토 효모 추출	BD 생명과학	212750	LB 미디엄
카나마이신 설페이트	시그마-올드리치	K1914	항생제
리팜피신	MP 생의학	219549005	항생제
염화나트륨	암레스코	0241-10KG	LB 미디엄