박테리아 감염 시각화를 위한 마우스 방광 조직 준비

Abstract

출처: O'Brien, V. P. 외, 쥐에서 Gardnerella vaginalis의 방광 노출로 유발된 재발성 대장균 요로 감염. J. Vis. Exp. (2020)

이 영상은 감염 전 생쥐 모델의 방광 상피에서 박테리아 정착과 숙주-병원체 상호작용을 시각화하기 위해 주사 전자현미경을 사용해 시연합니다.

Protocol

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 주사 전자현미경을 이용한 방광 영상

   참고: 이 절차는 요상피의 시각화가 필요한 시점에 언제든지 시행할 수 있습니다. 그림 1 (보라색 상자)에 나타난 바와 같이, 요로병원성 대장균 (UPEC)과 요로피 상호작용은 UPEC 접종 후 6시간에서 24시간 사이에 저장소 형성 단계에서 가장 잘 관찰되며, Gardnerella vaginalis 에 의해 유발되는 요로피 탈출은 두 번째 G . 질 노출 후 3시간에서 12시간 사이에 가장 잘 관찰됩니다.

   1. 현장 방광 고정
      1. 방광 수확 직전에 pH 7.4_{에서 2} mM CaCl2와 함께 0.15M 카코딜레이트 나트륨 완충제에 글루타알데히드(2.5% 최종 알코올)와 파라포름알데히드(2% 최종 포함)를 첨가하여 고정제를 준비합니다. 새로 개봉한 유리 앰플에서 파라포름알데히드와 글루타알데히드를 사용하세요. 두 고정제 모두 개봉 용기에서 시간이 지나면서 산화됩니다. 주의: 글루타알데히드는 독성이 있으며, 호흡기 자극제이며 부식성이 있습니다; 파라포름알데히드는 가연성, 발암성, 자극제, 생식 독소입니다; 카코딜레이트나트륨은 독성이 있고 발암성이 있습니다.
      2. 고정액 50mL를 만들기 위해 16% 파라포르알데히드 6.25mL, 50% 글루타르알데히드 2mL, 초순수 16.75mL를 pH 7.4의 0.3M 카코딜레이트 용액 25mL와 4 mM CaCl2를_{첨가합니다.}
      3. 방광에 투여하기 전에 준비된 고정제를 37°C로 데웁니다.
      4. 투베르쿨린 슬립팁 주사기에 고정제를 채우고, 끝에 카테터를 삽입하며, 베벨은 주사기 마킹과 반대편을 향합니다. 바늘 끝에서 1-2mm 떨어진 부분에서 남는 튜브를 잘라내고, 바늘 끝이 노출되지 않도록 주의하세요. 주사기를 튕겨 기포를 제거하고, 플런저를 빈 공기로 밀어 넣은 뒤 미세원심분리관을 통해 고정제를 카테터에 채워 고정제를 채워 적절한 폐기하세요.
      5. 승인된 방법(예: 마취 하 경추 탈구)을 사용하여 쥐를 마취하고 희생시킵니다. 다리를 고무줄이나 핀으로 고정한 채 해부면에 마우스를 올려놓으세요. 겸자와 수술용 가위로 쥐의 골반 부위를 열어 방광을 노출하세요. 인접한 지방을 조심스럽게 밀어내되 방광은 그대로 두세요.
      6. 주사기를 주로 잡는 손으로 바늘을 아래로 향하게 하고, 바늘 베벨과 주사기 표시는 몸을 반대로 향하게 하세요. 카테터 끝을 멸균 윤활제에 담가.
      7. 카테터 끝을 요도 입구에 위치시키고, 주사기 배럴을 쥐 몸체 위에 30-45° 각도로 고정하세요.
      8. 끝부분을 아주 작은 시계 방향으로 아래로 압력을 가한 후 카테터를 요도에 부드럽게 삽입합니다. 카테터 끝이 요도에 들어가면, 주사기를 쥐의 꼬리 쪽으로 경첩으로 돌리면서 카테터를 요도 안으로 더 밀어 넣어 주사기 배럴이 작업 표면과 평행하게 만듭니다. 카테터 바늘 축 전체(밑부분 제외)가 마우스 안으로 들어가 카테터 끝이 방광 내강 내에 위치하도록 해야 합니다.
      9. 50-80 μL의 고정제를 천천히 투여하면 방광이 풍선처럼 부풀어 오르게 합니다. 카테터를 고정한 채 주사기를 살짝 들어 올려 끝을 위로 기울이세요.
      10. 다른 손으로는 항전 고정기를 열고 요도와 교차하는 카테터 바늘 밑에 한 갈래를 밀어 넣으세요. 지혈기를 부분적으로 닫아 바늘에 닿을 정도로 유지하세요.
      11. 카테터 바늘을 방광에서 부드럽게 빼내면서 동시에 고정제가 완전히 고정되도록 고정 장치를 고정하고 잠가세요.
      12. 수혈기를 작업면과 평행하게 잡고 방광이 위에 놓이도록 하세요. 지혈기가 연결된 상태에서 방광을 제거하기 위해 조심스럽게 들어 올려 보세요.
      13. 블래더와 부착된 지혈제를 가열한 고정제가 들어있는 팔콘 튜브에 넣으세요. 방광이 액체에 완전히 잠기고 튜브 벽에 눌리지 않도록 하세요. 4°C에서 24시간 배양하세요.
   2. 주사 전자현미경(SEM)을 이용한 방광 처리 및 영상
      1. 깨끗이 닦은 양면 면도날로 방광을 시상식으로 반으로 가로지르고, 수혈기 쪽으로 접선 방향으로 두 번째 절개를 하여 방광을 배출하세요. 이로 인해 두 개의 반방광 '컵'이 만들어집니다. 방광 외부에 남아 있는 지방 패드가 있다면 부드럽게 제거하세요.
      2. 방광 반쪽을 나트륨 카코딜레이트 완충제(0.15 M, pH 7.4)에 세 번(각각 10분씩) 헹구세요.
      3. 0.15M 카코딜레이트 완충제에 1% 오스뮴 테트로박스를 상온에서 1시간 동안 염색합니다. 오스뮴은 빛에 민감하며; 따라서 염색 용기를 호일로 감싸 어두운 환경을 유지하며 이 과정을 수행하세요. ​
         주의: 오스뮴 테트록사이드는 피부에 독성이 있고 부식성이 있습니다. 장갑을 끼고 후드에서 이 단계를 하세요.
      4. 방광 반쪽을 초순수수에 세 번(각각 10분씩) 씻어내세요. 이 과정에서 때때로 수면에 삼습유가 관찰됩니다. 건조 과정에서 오염을 막기 위해 흡입하거나 맥을 제거하세요.
      5. 조직은 등급이 정해진 에탄올 시리즈(50, 70, 90, 100, 100%)에 각각 10분씩 담그어 탈수합니다.
      6. 임계점 건조기를 사용해 고정된 조직을 건조시키며, 가장 느린 속도로 12회의_CO2 교환을 수행합니다. 모든 추가 설정을 느리게 설정하고, 환기 단계는 빠르게 설정되어 있습니다.
      7. 깨끗한 양면 면도기로 각 방광 절반을 다시 반으로 나누어 총 4개의 조각을 만들어 표본의 곡률을 줄여 더 효율적인 코팅을 하고, SEM 영상 촬영을 용이하게 하며, 건조 중 말렸을 수 있는 조직을 노출시킵니다.
      8. 블래더 조각을 알루미늄 스텁의 전도성 탄소 접착제 탭에 붙이고, 이쑤시개로 접점이 닿는 부분 주변에 은색제를 소량 칠하되, 과도한 접착제가 블래더 내부 표면에 흡수되지 않도록 주의하세요.
      9. 고진공 스퍼터 코팅기를 사용해 샘플 스텁에 6nm 이리듐을 스퍼터 코팅하세요. 시료가 계속 충전된다면, 은색 페인트로 표면까지 전도성 경로를 칠하고 추가로 4nm 이리듐을 코팅하세요.
      10. 주사 전자현미경으로 샘플을 영상화하세요. 현미경에 따라 조건이 다를 수 있지만, 3 KeV의 가속 전압과 200 pA의 빔 전류, 12-13 mm 작동 거리는 Everhart-Thornley(SE2) 전자 검출기를 사용할 때 자이스 멀린 FE-SEM에서 잘 작동했습니다.

Results

그림 1. 마우스 모델 회로도. 타임라인은 프로토콜 에 명시된 모델의 단계나 절차를 반영하기 위해 강조되어 표시됩니다. 1단계(주황색): 세포 내 요로병원성 대장균 (UPEC) 저장소 구축. 쥐에게는 UPEC를 경요도 예방접종을 받고, 소변 샘플을 수집하여 세균뇨 제거를 모니터링합니다. 박테리아를 제거하는 쥐만이 다음 단계로 진행됩니다. 2단계(녹색): 방광 노출 가 드네렐라 보지날리스. 쥐는 G....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G x 1/2 바늘	BD	305106	카테터에 대해서는
5 1/2" 직선 겸자 제혈기	맥케슨	487377	현장 방광 고정
ACE 600 스퍼터 코팅기	라이카		SEM 샘플 처리
알루미늄 SEM 스텁	테드 펠라	16111	SEM 샘플 처리
염화칼슘	응급의료 서비스	12340	현장 방광 고정
전도성 탄소 접착 탭	테드 펠라	16084-1	SEM 샘플 처리
전도성 은색 페인트	테드 펠라	16034	SEM 샘플 처리
CPD 300 크리티컬 포인트 건조기	라이카		SEM 샘플 처리
사이토퍼널 금속 클립	수입	M964B	사이토스펀 요검사
에탄올	응급의료 서비스	15050	SEM 샘플 처리
포도당	시그마	G7528	NYCIII G. 질성 성장 매개체에 대해
글루타알데히드	응급의료 서비스	16320	현장 방광 고정
Hema 3 스테인닝 키트	피셔	23123869	사이토스펀 소변분석(Cytospun urinalysis)
젠장	셀그로	25-060-CL	NYCIII G. 질성 성장 매개체에 대해
이리듐	테드 펠라	91120	SEM 샘플 처리
멀린 FE-SEM	자이스		주사 전자현미경
밀리-Q 정수기	밀리포어	IQ-7000	SEM 샘플 처리
오스뮴 테트록사이드	응급의료 서비스	19170	SEM 샘플 처리
파라포름알데히드	응급의료 서비스	15710	현장 방광 고정
폴리에틸렌 튜빙	내부 구급	427401	카테터를 위한
프로테오스 펩톤 #3	피셔	DF-122-17-4	NYCIII G. 질성 성장 매개체에 대해
PTFE 코팅 양날 면도날	응급의료 서비스	72000	SEM을 위한 블래더 절단