제브라피시 배아에서 박테리아 분리 및 배양하여 감염 용량 평가

초록

출처: Bernut, A. 외, 얼룩말피시 배아에서 Mycobacterium absrumus 의 발병기전 해독 및 영상 분석. J . Vis. Exp. (2015).

이 영상은 감염된 제브라피시 배아에서 Mycobacterium abscessus 를 분리하고 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 배아 안락사, 조직 용해, 균질화를 통해 박테리아를 방출한 후, 원심분리 및 계면활성제 완충제 내 재현탁을 포함합니다. 마지막으로, 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 항생제 보조 한천에 도판한 후 배양하여 집락 형성과 정량화를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. M. abscessus 접종의 준비 및 보관
   1. M. abscessus 성장 조건
      1. -80°C 글리세롤 스톡에서 M . abscessus 를 OADC 10%와 글리세롤 0.5% 함유된 Middlebrook 7H10 한천(7H10OADc)에 배제하고, 형광 단백질을 암호화하는 벡터가 가진 내성 마커에 따라 적절한 항생제를 보충합니다. 플레이트를 30°C에서 4-5일간 배양하세요.
      2. 형광 양성 균세균 군락을 구입해 1ml 미들브룩 7H9 육수를 OADC, 0.2% 글리세롤, 0.05% 트윈 80(7H9OADc/T)과 필요한 항생제를 첨가한 15ml 멸균 플라스틱 튜브에 접종하세요. 30°C에서 1주일간 흔들지 않고 배양하세요.
         참고: 트윈 80은 뭉치와 박테리아 집결을 제한합니다.
      3. 2.1.2 용액을 50 ml Middlebrook 7H9OADc/T 내 150 cm2 조직 배양 플라스크에 재현탁하여 최종 0.1 OD₆₀₀ (약 5.107 박테리아/ml에 해당)으로 재현탁하고, 30 °C에서 4일간 추가 배양하여 기하급수적으로 성장하는 배양(OD₆₀₀ = 0.6에서 0.8)을 얻습니다.
         참고: 특히 거친 변이의 뭉치를 최소화하기 위해 잠복 기간은 5일을 넘지 않아야 합니다. 매끄러운 변종과 거친 변종 모두 비슷한 성장 속도를 보입니다.
2. M. abscessus 접종체 준비
   참고: 거친 M. abscessus 는 큰 집합체를 형성하고 줄을 생성하는 경향이 높기 때문에, 배아에 미세주입 전에 균질하고 양적으로 조절된 접종체를 생성하기 위한 특정한 처리가 필요합니다. 이 처리는 덩굴을 생성하는 매끄러운 박테리아에도 적용되지만, 거친 균주보다는 적은 정도입니다.
   1. 150 cm² 조직 배양 플라스크에서 4,000 x g에서 원심분리하여 50ml 멸균 플라스틱 튜브에서 15분간 RT 가열하여 기하급수적으로 증양된 배양물을 채취하고, 박테리아 펠릿을 1ml 7H9OADc/T에 재현탁합니다. 200μl의 박테리아 현탁액을 1.5ml 마이크로 원심분리관에 담아주세요.
      참고: 1ml 주사기에서 소량 부피로 작업하는 것이 매우 균일한 현탁액을 얻기 위해 필요합니다.
   2. 박테리아 현탁액을 26G 바늘(15회 상하 시퀀스)로 균질화하고, 워터욕 초음파 검사기를 사용해 10초간 세 번 초음파 검사를 합니다(각 초음파 과정 사이에 10초 휴식). 7H9OADc/T 1ml를 넣고 잠시 소용돌이를 돌리세요. 원심분리기 3분, 100 x g.
   3. 균류가 포함된 상원액을 조심스럽게 모아 뭉치가 생기지 않게 하고, 균질 현탁액을 50ml 멸균 플라스틱 튜브에 모으세요.
   4. 남은 박테리아 집합체가 있는지 육안으로 확인하세요.
      참고: 응집체가 여전히 남아 있다면 100 x g에서 2분간 추가 원심분리 단계로 진행하여 상원액을 채취합니다.
   5. 4,000 x g에서 5분간 원심분리한 후, 펠릿을 200 μl 7H9OADc/T에 재현탁한 후 주입을 진행합니다.
   6. 7H10OADc 한천에 1x PBST 연속 희석액을 도판하고, 30°C에서 4일간 배양한 후 집락형성 단위(CFU)를 계산하여 최종 박테리아 농도를 평가합니다. 각 새로운 배치마다 CFU를 결정해야 합니다.
   7. 냉동 접종 재고는 -80 °C에 5 μl 알리쿼트를 보관하여 준비합니다.
      참고: -80°C 냉동 알리코트에 대한 CFU 평가는 생존 가능한 박테리아의 정확한 수를 결정하는 전제 조건으로, 동결/해동이 접종물의 박테리아 생존성에 영향을 줄 수 있기 때문입니다. 이 냉동 접종체는 이후 주사에 사용할 준비가 되어 있습니다. 모든 알리코트가 동일한 수의 CFU를 포함하기 때문에, 한 실험에서 다른 실험으로 재현 가능한 방식으로 박테리아를 주입할 수 있습니다.
3. 접종 품질 관리
   참고: 지엘-닐슨 염색(마이코박테리아에 특이적)은 균질 절차 전후의 박테리아 현탁액의 품질을 비교하는 데 사용될 수 있습니다.
   1. 균질화된 박테리아 현탁액 한 방울을 유리 슬라이드에 펴서 완전히 건조시키세요. 65-70도도로 설정된 핫플레이트에서 최소 30분 동안 얼룩을 고정하고 Ziehl-Neelsen 염색 프로토콜을 사용해 스테인을 발라.
   2. 100배 대물렌즈를 사용해 현미경으로 박테리아 도말을 관찰하고, 가공되지 않은 박테리아 현탁액의 도말과 비교하세요 (그림 1).

2. 제브라피시 배아 준비

1. 제브라피시 알의 산란 및 수집
   1. 산란 전날에는 수컷 2마리와 암컷 1마리(보통 2:1 비율로 최적의 수정율을 위해 적합)를 번식실에 넣어 번식실을 마련하고, 이 방에는 알 수집 바구니가 있습니다.
      참고: 알 수집 바구니는 부모가 알을 먹지 않도록 보호하고 알 수확을 돕기 위해 사용됩니다.
   2. 1 hpf 기준으로, 100mm 페트리 접시에 25ml 블루 피쉬 워터(한 접시당 최대 100개 배아)를 채취하여 28.5 °C에서 보관합니다. 수정되지 않은 난자는 폐기됩니다.
2. 주사를 위한 제브라피시 배아 준비
   1. 수정 후 약 24시간(hpf)에 100mm 페트리 접시에서 가는 핀셋으로 배아를 탈코리오온화하여 28.5 °C에서 유지합니다.
   2. 피펫을 사용해 30-48 hpf 배아를 채취하여 270 mg/L 트라이카인이 함유된 25ml의 어류 물이 채워진 'V'자 모양의 위치 챔버로 옮깁니다. 배아를 홈메이드 마이크로로더 팁 도구(홈메이드 클립 마이크로로더 팁)를 사용해 채널에 올바르게 배치하세요. 이 도구는 마이크로 조작이 용이합니다.
      참고: 정맥 주사는 꼬리정맥에 주사할 때는 등쪽을 아래로 향하게 하고, 꼬리 근육 주사를 시행할 때는 등쪽을 위로 향하세요.

3. 미세 주입 절차

참고: M. abscessus 감염의 연대기(생존율, 박테리아 부하, 반응학 및 감염 특성)를 평가하기 위해 30개의 hpf 배아를 꼬리정맥에 주사하는 것이 선호됩니다. 면역 세포 모집을 시각화하기 위해 주사는 48 hpf 배아의 꼬리 근육과 같은 국소 부위에 시행됩니다.

1. 투여할 CFU 수에 따라 1X PBST에 미코박테리아 접종물을 희석하여 적혈 페놀 10%를 포함해 적절한 주입을 확인한다.
2. 마이크로로더 팁을 사용해 5-10 μl의 박테리아 접종 주입 바늘을 장전하고, 주입기에 연결된 3차원 마이크로매니퓰레이터 홀더에 마이크로 주입 바늘을 연결한 뒤, 가는 핀셋으로 바늘 윗부분을 부러뜨려 5-10 μm의 개구 직경을 얻습니다.
3. 미세 주입 압력(20-50 hPa)과 시간(0.2초)을 조정하여 주입량을 보정합니다.
   참고: 필요한 주입량은 배아의 황자로 배출된 방울의 직경을 시각적으로 측정하여 보정됩니다.
4. 꼬리정맥 주입 시에는 배아를 배측이 바늘을 향하도록 위치시키고, 바늘 끝을 요로 생식기 입구 가까이에 놓아 꼬리정맥을 겨냥한 뒤, 바늘 끝을 배아 안으로 부드럽게 밀어 넣어 꼬리정맥 부위를 겨우 관통합니다. 원하는 양의 박테리아 제제를 투여하는데, 보통 약 100 CFU/nl 포함 1-3 nl입니다.
5. 근육 주사의 경우, 배아의 배를 바늘 쪽을 향하게 한 쪽으로 위치시키고, 바늘을 한 체에 대고 소량(1 nl)의 접종을 주입합니다.
   참고: 꼬리정맥 주사와 관련해서는, 근육 내 주사도 시행이 어렵습니다. 과부하가 주변 조직에 손상을 줄 수 있으므로 주의해야 합니다.
6. 주사 절차가 끝나면, 동일한 양의 박테리아 현탁액을 멸균 PBST 한 방울에 주입한 후 7H10OADc에 플레이트를 부착하고 CFU를 계산하여 접종량을 조절합니다. 약 100개의 배아에 바늘을 주입할 수 있습니다.
   참고: 거친 M. abscessus 는 바늘 내에 응집체가 계속 형성될 수 있으므로, 접종 준비 직후 주사를 해야 합니다.
7. 감염된 어류를 24웰 플레이트에 개별 옮기고, 28.5 °C에서 배양합니다. 1-3 nl 1X PBS를 주입한 배아를 대조군으로 사용할 수 있습니다.
8. 형광 박테리아의 적절한 감염은 형광 현미경을 사용하여 모니터링합니다.

4. 박테리아 부하 정량화

1. CFU 열거에 의한 결정
   1. 원하는 시점에 감염된 배아(각 조건당 5개)를 1.5ml 마이크로 원심분리관(1개의 배아/튜브)에 모아 10분간 얼음 배양하여 냉동 마취시키고, 트리카인 과다복용(300-500 mg/L)으로 안락사시킵니다
   2. 배아를 멸균수로 두 번 세척한 후 새 튜브에 분사하세요. 각 배아에 26G 바늘을 사용해 2% Triton X-100을 1X PBST에 희석하여 용해시키고, 현탁액을 균질화하여 완전히 용해됩니다. 서스펜션을 원심분리하고 0.05% 트윈 80을 넣은 1X PBST에 펠릿을 재현탁하세요. 동질액의 연속 희석은 Middlebrook 7H10OADc에 도금하고, 공급업체가 권장하는 대로 BBL MGIT PANTA로 보충합니다.
      참고: M. abscessus 는 M. marinum 보다 NaOH 처리에 더 취약합니다.Bbl의 MGIT PANTA 항생제 혼합제를 사용하여 M . abscessus 성장에 영향을 주지 않고 어류 용해액을 성공적으로 제거할 수 있습니다.
   3. 플레이트를 30°C에서 4일간 부양시키고 군집을 세세요.

결과

그림 1. 분산된 M. abscessus 접종체 제제.R형 또는 S 변종의 Ziehl-Neelsen 염색은 처리 전(상단 패널) 또는 처리 후(하단 패널)에서 육수 배양액 위에 증육하여 마이코박테리아 집합체의 크기와 수를 줄이기 위해 주사기, 초음파 검사, 디캔테이션을 반복합니다. 박테리아는 100X APO 오일 1.4 NA 대물렌즈를 사용한 현미경으로 관찰되었습니다. 스케일...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BBL MGIT 판타	BD 생명과학	245114
소 혈청 알부민	유로메덱스	04-100-811-E
소 간에서 얻은 카탈라제	시그마-올드리치	C40
디프코 미들브룩 7H10 아가르	BD 생명과학	262710
디프코 미들브룩 7H9 브로스	BD 생명과학	271310
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 소금 (트리카인)	시그마-올드리치	A5040
올레산	시그마-올드리치	O1008
파라포름알데히드	델타 현미경	15710
페놀 레드	시그마-올드리치	319244
트윈 80	시그마-올드리치	P4780
아가르	깁코 라이프 테크놀로지	30391-023
저 융해 아가로스	시그마-올드리치
즉석 해양 소금	아쿠아리움 시스템즈 주식회사
붕규산 유리 모세혈관	서터 악기 주식회사	BF100-78-10	1mm 외경 X 0.78 mm 내경
마이크로피펫 풀러 장치	서터 인스트루먼트 주식회사		플래밍/브라운 마이크로피펫 풀러 p-87
마이크로인젝터	트라이테크 리서치		디지털 마이크로인젝터, MINJ-D
핀셋	사이언스 툴즈 주식회사		듀몽 # M5S
마이크로로더 팁	에펜도르프