제브라피시 배아에서 박테리아 분리 및 배양하여 감염 용량 평가

초록

출처: Bernut, A. 외, 얼룩말피시 배아에서 Mycobacterium absrumus 의 발병기전 해독 및 영상 분석. J . Vis. Exp. (2015).

이 영상은 감염된 제브라피시 배아에서 Mycobacterium abscessus 를 분리하고 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 배아 안락사, 조직 용해, 균질화를 통해 박테리아를 방출한 후, 원심분리 및 계면활성제 완충제 내 재현탁을 포함합니다. 마지막으로, 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 항생제 보조 한천에 도판한 후 배양하여 집락 형성과 정량화를 가능하게 합니다.

프로토콜

1. M. abscessus 접종의 준비 및 보관
   1. M. abscessus 성장 조건
      1. -80°C 글리세롤 스톡에서 M . abscessus 를 OADC 10%와 글리세롤 0.5% 함유된 Middlebrook 7H10 한천(7H10OADc)에 배제하고, 형광 단백질을 암호화하는 벡터가 가진 내성 마커에 따라 적절한 항생제를 보충합니다. 플레이트를 30°C에서 4-5일간 배양하세요.
      2. 형광 양성 균세균 군락을 구입해 1ml 미들브룩 7H9 육수를 OADC, 0.2% 글리세롤, 0.05% 트윈 80(7H9OADc/T)과 필요한 항생제를 첨가한 15ml 멸균 플라스틱 튜브에 접종하세요. 30°C에서 1주일간 흔들지 않고 배양하세요.
         참고: 트윈 80은 뭉치와 박테리아 집결을 제한합니다.
      3. 2.1.2 용액을 50 ml Middlebrook 7H9OADc/T 내 150 cm2 조직 배양 플라스크에 재현탁하여 최종 0.1 OD₆₀₀ (약 5.107 박테리아/ml에 해당)으로 재현탁하고, ....

결과

그림 1. 분산된 M. abscessus 접종체 제제.R형 또는 S 변종의 Ziehl-Neelsen 염색은 처리 전(상단 패널) 또는 처리 후(하단 패널)에서 육수 배양액 위에 증육하여 마이코박테리아 집합체의 크기와 수를 줄이기 위해 주사기, 초음파 검사, 디캔테이션을 반복합니다. 박테리아는 100X APO 오일 1.4 NA 대물렌즈를 사용한 현미경으로 관찰되었습니다. 스케일.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BBL MGIT 판타	BD 생명과학	245114
소 혈청 알부민	유로메덱스	04-100-811-E
소 간에서 얻은 카탈라제	시그마-올드리치	C40
디프코 미들브룩 7H10 아가르	BD 생명과학	262710
디프코 미들브룩 7H9 브로스	BD 생명과학	271310
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 소금 (트리카인)	시그마-올드리치	A5040
올레산	시그마-올드리치	O1008
파라포름알데히드	델타 현미경	15710
페놀 레드	시그마-올드리치	319244
트윈 80	시그마-올드리치	P4780
아가르	깁코 라이프 테크놀로지	30391-023
저 융해 아가로스	시그마-올드리치
즉석 해양 소금	아쿠아리움 시스템즈 주식회사
붕규산 유리 모세혈관	서터 악기 주식회사	BF100-78-10	1mm 외경 X 0.78 mm 내경
마이크로피펫 풀러 장치	서터 인스트루먼트 주식회사		플래밍/브라운 마이크로피펫 풀러 p-87
마이크로인젝터	트라이테크 리서치		디지털 마이크로인젝터, MINJ-D
핀셋	사이언스 툴즈 주식회사		듀몽 # M5S
마이크로로더 팁	에펜도르프