생존 분석법을 이용한 C. elegans의 에어로모나스 병태 모델링

초록

출처: 첸, Y. 외. Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 C. elegans 를 이용한 생존 분석으로 에어 로모나스 병태를 모델링하며, 경구 섭취가 장내 감염과 사망률을 유발하여 살아있는 숙주 시스템에서 박테리아의 병원성을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 에어로모나스를 이용한 C. elegans 생존 검사

1. E . coli OP50과 함께 퍼지는 ENGM(농축선충 성장 배지)에 L1 벌레를 씨앗 뿌리는 날, 네 가지 Aeromonas 균주 또는 대 장균 OP50 각각의 군락을 하나씩 채취하여 각각 2mL LB 육수와 함께 37°C에서 16시간 배양합니다.
   참고: 오염을 방지하기 위해 이 단계는 층류 후드에서 수행해야 합니다. 여기서는 다음과 같은 박테리아 균주가 사용되었습니다: C. elegans의 일반적인 먹이원인 E. coli OP50, 최초로 완전히 염기서열이 확정된 임상 A. dhakensis 분리주인 A. dhakensis AAK1. A. 하이드로필라 A2-066, A. veronii A2-007, A. caviae A2-9307121은 국립성공대학교병원에서 대표적인 임상 분리균입니다.
2. 박테리아 육수의 OD₆₀₀ (600 nm 광밀도) 흡광도를 측정하고, LB 육수를 기준으로 OD₆₀₀ = 2.0으로 조절합니다.
3. 각 6cm NGM(선충 배양지) 플레이트 위에 30μL의 박테리아 육수를 점적으로 뿌려 바릅니다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 배양하세요.
   참고: NGM을 준비하기 위해 3g NaCl(염화나트륨), 2.5g 박테리아 펩톤, 20g 한천을 1L 탈이온수에 녹입니다. 121°C에서 20분간 오토클레이브. 물욕에서 55°C까지 식힌 후, 1 mL 1 M CaCl₂ (염화칼슘), 1 mL 1 M MgSO₄ (황산마그네슘), 5% 콜레스테롤 1 mL 에탄올, 25 mL 인산 완충제를 추가합니다. 잘 섞이려면 소용돌이치세요.
4. L1 벌레가 L4 단계로 성장하는 날, 무작위로 50마리의 벌레를 골라 네 가지 Aeromonas 균주나 대장균 OP50이 포함된 NGM 플레이트에 옮깁니다.
5. 분석이 완료될 때까지 NGM 플레이트를 20 °C에서 배양합니다.
6. 모든 살아있는 벌레를 새로 준비한 NGM 플레이트에 박테리아가 섞인 상태로 옮기고, 매일 살아있는 벌레, 죽은 벌레, 센서벌레의 수를 세어 마지막 벌레가 죽을 때까지 반복합니다.
   참고: 감염 유지를 위해 매일 새로 준비된 NGM 플레이트로 기생충을 옮기세요. 불임 벌레(예: glp-4 또는 FudR)를 사용하더라도 말이죠.
7. 일일 데이터 계산을 바탕으로 생존 곡선을 그립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셰이커 인큐베이터	이이더	LM-570R	박테리아 배양
나클	시그마	31434	배양지 준비
MgSO₄	시그마	M7506	배양지 준비
아가르	디프코	214530	배양지 준비
CaCl₂	시그마	C1016	배양지 준비
콜레스테롤	시그마	C8503	배양지 준비
6cm 페트리 플레이트	알파 플러스	46	한천 플레이트 준비
박테리아 펩톤	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	배양지 준비
퓨드R	시그마	1271008	배양지 준비
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