C. elegans 액체 독성 검사를 이용한 박테리아 병원성 평가

초록

출처: 첸, Y. 외. Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018).

이 영상은 영양소가 제한된 액체 환경에서 벌레의 생존을 측정하여 박테리아 병원성을 평가하는 C . elegans 의 액상 독성 검사법인 Aeromonas를 시연합니다. 이 검사는 C. elegans에서 독소 유발 손상과 사망률의 정도를 바탕으로 균주별 특이적 병원성을 밝혀냅니다.

프로토콜

1. C. elegans 에어로모나스를 이용한 액체 독성 검사

참고: 오염을 방지하기 위해서는 층류 후드에서 단계를 수행해야 합니다.

1. L1 벌레를 ENGM(강화 선충 성장 배지) 판에 E . coli OP50으로 뿌린 다음 날, 네 가지 Aeromonas 균주와 E. coli OP50 각각의 단일 군집을 채취하여 각각 5mL LB 육수와 37°C에서 16시간 배양합니다.
   참고: 프로토콜에서는 다음과 같은 박테리아 균주가 사용되었습니다: C. elegans의 정상적인 먹이원인 E. coli OP50, 최초의 완전 시퀀싱된 임상 병원성 A. dhakensis 분리주인 A. dhakensis AAK1. A. 하이드로필라 A2-066, A. veronii A2-007, A. caviae A2-9307121은 국립성공대학교병원에서 대표적으로 임상 분리된 균입니다.  
   참고: 농축된 NGM(ENGM)을 제조하기 위해 3g NaCl, 5g 박테리아 펩톤, 1g 효모 추출물, 30g 한천을 1L 탈이온수에 용해시킵니다. 121°C에서 20분간 오토클레이브. 55°C까지 물욕에서 식힌 후, 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄, 1 mL 5% 콜레스테롤 에탄올, 25 mL 인산염 완충제를 추가합니다. 잘 섞이려면 소용돌이치세요.
2. 박테리아 육수의 OD₆₀₀ 흡입도를 측정하세요.
3. 박테리아 육수를 3,500 x g 에서 15분간 원심분리하여 LB 육수를 제거하세요. 박테리아를 재현탁하고 세균 육수를 OD₆₀₀ = 3.0으로 조절하고 S 배지를 사용하세요. 96웰 플레이트 중 최소 8개의 웰에 S 매개체에 195 μL 박테리아 육수를 추가합니다.
   참고: S 배지의 조성: S 배지를 준비할 때, 사용 전에 40 mL S Basal, 0.4 mL 1 M 시트레이트 칼륨, 0.4 mL 미량 금속 용액, 1 M CaCl₂ 0.12 mL, 1 M MgSO₄ 0.12 mL, 에탄올 5% 콜레스테롤 40 μL, 8 mM FudR 1 mL를 혼합하여 사용 전에 사용한다.
4. Engm 플레이트의 L4 벌레는 M9 배지를 사용해 대 장 균 OP5로 세척하세요. 웜 용액을 μL당 5개의 웜 농도로 조절하고, 96웰 플레이트의 각 웰에 5 μL의 웜 용액을 추가합니다. 우물당 약 25마리의 벌레가 있는지 확인하세요.
5. 96웰 플레이트를 셰이커에서 200rpm, 25°C에서 인큐베이션합니다.
6. 24시간, 48시간, 72시간 후에 살아있는 벌레와 죽은 벌레의 수를 세어보세요. 각 우물의 생존율을 다음 공식으로 계산합니다: (살아있는 벌레/총 지렁이) × 100%입니다.
7. 일일 데이터 계산으로 산점도 그래프를 그려보세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셰이커 인큐베이터	이이더	LM-570R	박테리아 배양
나클	시그마	31434	배양지 준비
MgSO₄	시그마	M7506	배양지 준비
아가르	디프코	214530	배양지 준비
CaCl₂	시그마	C1016	배양지 준비
콜레스테롤	시그마	C8503	배양지 준비
에탄올	시그마	32205	배양지 준비
코	시그마	P5958	배양지 준비
6cm 페트리 플레이트	알파 플러스	46	한천 플레이트 준비
96웰 플레이트	팔콘	353072	액체 분석
박테리아 펩톤	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	배양지 준비
효모 추출물	시그마	92144	배양지 준비
구연산 •H₂O	시그마	1909년경	배양지 준비
삼칼륨 시트레이트•H₂O	시그마	104956	배양지 준비
퓨드R	시그마	1271008	배양지 준비
디나트륨 EDTA	시그마	E1644	배양지 준비
트립톤	시그마	16922	배양지 준비
현미경 시스템	니콘	이클립아스 Ti 역전형(Eclipase Ti)	현미경 영상
과학용 CCD 카메라	QImaging	레티가-2000R 패스트 1394	현미경 영상