병원성 에어로모나스 균주에 의해 유도된 C. elegans의 근육 괴사 검사

초록

출처: Chen, Y. 외, Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 병원성 Aeromonas 균주를 이용한 C. elegans(Caenorhabditis elegans)의 근육 괴사 검사를 시연합니다. Aeromonas 씨앗 판에 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 벌레를 먹여 박테리아 감염을 모델링하고 형광 영상을 통해 조직 손상을 밝힙니다. 근육 구조와 GFP 신호의 점진적 손실은 아에로모나스에 의한 괴사 반응을 나타냅니다.

프로토콜

1. 카이노랍디티스 엘레간스 근육괴사 검사 에어로모나스

참고: 오염을 방지하기 위해 이러한 단계는 층류 후드에서 수행되어야 합니다.

1. L1 벌레가 Escherichia coli OP50으로 퍼진 선충 성장 배지(ENGM)에 씨앗을 뿌리는 날, 네 가지 Aeromonas 균주와 대장균 OP50 각각의 군락을 하나씩 채취하여 각각 2mL Luria-Bertani(LB) 육수와 37°C에서 16시간 배양합니다. 참고: 여기서는 다음 박테리아 균주를 사용했습니다: 대장균 C. elegans의 정상적인 먹이원인 OP50 . A. dhakensis AAK1, 최초로 완전히 염기서열이 확인된 임상 A. dhakensis 분리주. A. 하이드로필라 A2-066, A. veronii A2-007, A. caviae A2-9307121은 국립성공대학교병원에서 대표적인 임상 분리균입니다.
2. 박테리아 육수의 OD₆₀₀ 흡광도를 측정하고, LB 육수로 OD₆₀₀ = 2.0으로 조절하세요. 6cm 선충 배양지(NGM) 플레이트에 30μL의 박테리아 육수를 스팟 후 바릅니다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 배양하세요.
3. L1 벌레가 L4 단계로 성장하는 날, 각 NGM 판에 네 가지 Aeromonas 균주 또는 대장균 OP50을 각각 50마리씩 옮깁니다. NGM 플레이트를 20°C에서 배양하세요. 24시간마다 벌레를 박테리아가 포함된 새로 준비한 NGM 플레이트로 옮깁니다.
4. 형광 현미경으로 근육 이미지를 촬영하세요.
   1. 슬라이드 위에 2% 아가로스 젤에 10마리의 벌레를 무작위로 뽑아 M9 배지에 묻혀 놓습니다. 2 μL 1% 아지드 나트륨을 M9 배지에 아가로스 위에 마비시키고 5분 미만 후 영상을 촬영합니다.
   2. 커버 슬립을 끼우고 형광 현미경과 전하 결합 장치 카메라에 녹색 형광 단백질(GFP) 필터를 사용해 근육 이미지를 촬영하세요. L4 단계 후 24, 48, 72시에 근육 이미지를 촬영하세요.

이미지 분석 및 도형 준비를 이미지 처리 소프트웨어를 사용하세요.
참고: 점수와 근육 손상 수준 정의는 그림 1에 나와 있으며, 기준은 다음과 같습니다: 근섬유 결손에 대해 3점; 파열되거나 파손된 근섬유는 2점; 근섬유가 휘어진 경우 1점; 건강한 근섬유는 0점입니다.

결과

그림 1: 에어로모나스 감염에 의해 유발 된 C. elegans의 근육 괴사에 대한 해당 점수. 근육 괴사의 기준과 해당 점수는 다음과 같습니다: 근섬유 결손에 대해 3점; 파열되거나 파손된 근섬유는 2점; 근섬유가 휘어진 경우 1점; 건강한 근섬유는 0점입니다. 휘어진 근섬유(화살), 파열된 근섬유(...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셰이커 인큐베이터	이이더	LM-570R	박테리아 배양
K₂HPO₄	J.T. 베이커	MP021519455	배양지 준비
KH₂PO₄	J.T. 베이커	3246-05	배양지 준비
Na₂HPO₄	J.T. 베이커	MP021914405	배양지 준비
나클	시그마	31434	배양지 준비
MgSO₄	시그마	M7506	배양지 준비
아가르	디프코	214530	배양지 준비
CaCl₂	시그마	C1016	배양지 준비
콜레스테롤	시그마	C8503	배양지 준비
에탄올	시그마	32205	배양지 준비
코	시그마	P5958	배양지 준비
6cm 페트리 플레이트	알파 플러스	46	한천 플레이트 준비
박테리아 펩톤	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	배양지 준비
효모 추출물	시그마	92144	배양지 준비
구연산 •H₂O	시그마	1909년경	배양지 준비
삼칼륨 시트레이트•H₂O	시그마	104956	배양지 준비
퓨드R	시그마	1271008	배양지 준비
디나트륨 EDTA	시그마	E1644	배양지 준비
FeSO₄·7H₂O	시그마	215422	배양지 준비
MnCl₂·4H₂O	시그마	221279	배양지 준비
ZnSO₄·7H₂O	시그마	204986	배양지 준비
CuSO₄·5H₂O	시그마	C8027	배양지 준비
트립톤	시그마	16922	배양지 준비
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