컬리 섬유 매개 박테리아 하이드로겔 패턴의 안정화

초록

출처: Spiesz, E. M. 외, DIY 바이오프린터를 이용한 설계 바이오필름의 3차원 패턴화. J. Vis. Exp. (2019)

이 영상은 대조군 또는 유전자 조작 박테리아 균주를 포함한 3D 프린팅 알지네이트 패턴을 비교하는 방법을 시연합니다. 시험 균주는 유도 시 컬리 섬유를 생성하여 알지네이트 하이드로겔 구조를 강화합니다. 칼슘 킬레이팅 용액으로 처리한 후에는 테스트 패턴만 그대로 남아 컬리 섬유 생산의 안정화 효과를 강조합니다.

프로토콜

1. 3D 인쇄 공정

1. 컴퓨터에서 3D 프린팅 소프트웨어(재료표)를 설치하고 실행하세요. 3D 프린터를 컴퓨터에 연결하세요. 프린트 헤드를 홈 위치로 이동하려면 X, Y, Z 축의 홈 버튼을 클릭하세요.
2. 각 인쇄마다 인쇄 베드의 특정 위치에 미리 준비된 인쇄 기판을 놓습니다.
3. Z축에서 프린트헤드 높이를 보정하세요.
   1. 수동으로 제어하여 프린트 헤드를 22mm 높이로 올려 원하는 위치로 이동할 때 페트리 접시 가장자리와 충돌하지 않도록 하세요. 프린트 헤드를 플레이트 위에 올려놓고, 피펫 팁이 인쇄 표면에 닿을 때까지 아래로 옮깁니다. 이 Z축 위치를 Z1(인쇄 표면의 높이)로 할당합니다.
   2. 프린트 헤드를 들어 올려 X, Y, Z축에서 수동 조작으로 플레이트 영역 밖으로 이동시킵니다. 프린트헤드와 판 표면 사이의 작업 거리가 Z2로 정의되어 있다면, 인쇄 중에 Z-값으로 Z1 + Z2를 입력합니다.
4. 원하는 궤적에 따라 점별 좌표 결정 방법으로 자체 개발한 인쇄 형태를 프로그래밍합니다.
   1. 원하는 궤적이 직선이라면 시작점과 끝점만 정의하세요. 곡선에 추가 점을 포함하면 곡선이 더 부드러워집니다. 프린트 헤드를 수동으로 각 지점에 순서대로 이동시키고, 각 지점들의 좌표를 순서대로 기록하세요. 이 모든 좌표와 각 인쇄 구간의 인쇄 속도 이동 속도를 G-코드 편집기에 입력하세요.
5. 인쇄 전후로 모두 인쇄 헤드를 판 가장자리보다 높이(20mm) 들어 올린 후 판 영역 바로 밖으로 이동시킵니다. 이 프로그램을 G코드 파일로 저장하고 다음 인쇄에서 직접 로드한 뒤, 각 새로운 인쇄 기판마다 Z축 높이를 다시 측정하세요.
   참고: 정사각형 인쇄용 G-코드 예시는 표 1을 참조하세요.
6. 미리 프로그래밍된 G-코드 파일을 불러와. 소프트웨어에서 G-코드 편집기를 열고 원하는 도형을 인쇄하는 명령어를 프로그래밍하세요. 각 명령줄에서 프린트헤드의 X, Y, Z 축 위치를 변경할 수 있습니다. 모든 인쇄 단계에서 Z값을 Z1 + Z2(인쇄면 높이 + 작업 거리)로 입력하세요.
   참고: 이동 속도도 조절 가능하며; 9,000 mm/min은 일반적인 인쇄 속도에 적합한 값입니다.
7. 액체 바이오잉크를 주사기에 넣고 3D 바이오프린터의 주사기 펌프에 장착하세요.
8. 인쇄 버튼을 클릭하여 바이오 잉크를 인쇄 기판에 출력하세요.
9. 인쇄 중에는 프린트헤드의 움직임을 소프트웨어가 전적으로 제어합니다. 프린트 헤드가 인쇄 표면에 닿기 전에 주사기 펌프를 수동으로 작동시키세요.
   참고: 주사기 펌프와 프린터의 조율은 압출 속도, 프린트 헤드가 첫 번째 인쇄 지점으로 이동하는 속도, 그리고 프린트헤드의 초기 위치에 따라 경험적으로 결정됩니다. 초기 인쇄 헤드 위치가 20 mm이고, 인쇄 속도가 분당 9,000 mm, 압출 속도가 0.1 mL/h라면, 인쇄 시작 직후 주사기 펌프를 작동시킵니다. 압출 속도를 0.1 mL/h에서 0.3 mL/h로 변경하면, 인쇄 시작 후 주사기 펌프를 2⁰ 3초 기다렸다가 작동시킵니다.
10. 프린트 헤드가 마지막 인쇄 지점에 도착하면 즉시 주사기 펌프를 멈추세요. 인쇄 과정이 끝날 때 인쇄 헤드가 들어 올리기 전에 주사기 펌프를 멈추세요. 그렇지 않으면 과도한 바이오 잉크가 인쇄 기판에 떨어져 인쇄 해상도가 떨어집니다.
11. 3D 구조물을 구성할 때는 G-코드 편집기에서 프린트 헤드의 모든 움직임을 제어합니다. 첫 번째 레이어의 인쇄 높이를 입력하세요. 두 번째 레이어에서 G-코드의 Z-값을 0.2밀리미터 올려 인쇄 높이를 높이세요. 그 후 더 높은 층으로 이동할 때 Z-값을 0.1밀리미터 증가시킵니다. 인쇄 과정 중에는 판을 움직이지 마세요.
12. 인쇄된 하이드로겔의 너비와 높이를 측정하려면 샘플 아래나 옆에 강철 자를 놓으세요.

2. 대장균에 의한 바이오필름 생산 효과 재배 및 시험

1. 인쇄된 샘플을 실온에서 3−6일간 배양하여 바이오필름 성분(컬리 섬유)을 생산할 수 있도록 합니다. 카메라나 형광등 스캐너를 사용해 판을 촬영하세요.
2. 알지네이트 매트릭스를 용해시키기 위해 0.5 M 시트레이트 나트륨 용액 20mL(pH = 7, NaOH로 조정)를 인쇄 기판에 첨가하고, 상온에서 30rpm 진동으로 2시간 배양합니다. 액체를 버리고 시트레이트 처리 전 판 이미지와 비교하기 위해 다시 한 번 영상을 찍습니다.

표 1: 정사각형 인쇄를 위한 G-코드 프로그래밍 과정 및 설명.

G-코드 명령어	임무
G1 Z20 F9000	Z축을 20mm 높이로 들어 올리고 분당 9,000 mm의 이동 속도로 이동하세요.
G1 X95 Y65 F9000	첫 번째 라인의 출발점으로 9,000 mm/분의 이동 속도로 이동하세요.
G1 Z6 F9000	Z 방향으로 아래로 이동하여 적절한 인쇄 거리(여기서는 Z = 6 mm)를 확보합니다.
G1 X95 Y105 F300	첫 번째 줄의 끝점과 두 번째 줄의 시작점입니다.
G1 X135 Y105	두 번째 줄의 끝점이자 세 번째 줄의 시작점입니다.
G1 X135 Y65	세 번째 줄의 끝점이자 네 번째 줄의 시작점입니다.
G1 X95 Y65	네 번째 줄의 끝점이자 첫 번째 줄의 시작점; 사각형이 형성됩니다.
G1 Z20 F9000	Z축을 9,000 mm/분에서 20 mm 높이로 들어 올립니다.
G1 X55 Y40 F9000	페트리 접시 범위 밖의 좌표(55, 40)로 이동하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB 육수 가루	시그마-올드리치	L3022
궤도 셰이커	VWR	89032-092	모델 3500
페트리 접시	VWR	25384-326	150 x 15 mm
람노스	시그마-올드리치	83650
실리콘 튜빙	VWR	덴 3100103/25
주사기 펌프	프로센스 B.V.	NE-300
알지네이트 나트륨	시그마-올드리치	W201502
시트레이트 단염기성 나트륨	시그마-올드리치	71498
수산화나트륨	VWR	28244.295