형광 표지 박테리아의 염색체 분리 타임랩스 영상

초록

출처: Schumacher, D., 그리고 Sogaard-Andersen, L. 느리게 성장하는 사회성 박테리아 Myxococcus xanthus 의 완전한 영양 세포 주기의 형광 생세포 영상. J. Vis. Exp. (2018)

이 영상은 박테리아 세포 분열 중 형광 태그된 염색체 기원을 추적하기 위해 생세포 영상을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 타임랩스, 위상 차이 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 염색체 분리 역학을 포착합니다.

프로토콜

1. 현미경 설치 및 타임랩스 획득

참고: 여기서 설명한 프로토콜은 자동 초점, 100X/1.30 NA 오일 PH3 대물렌즈, X, Y 모터 스테이지, sCMOS 카메라, 광원, 녹색-형광, 적색-형광, 노란-형광 단백질 필터, 온도 제어 인큐베이션 챔버를 갖춘 역광각 현미경을 위해 개발되었습니다. 이 챔버는 세포를 빛으로부터 보호하고 일정한 온도를 유지합니다.

1. 현미경 검사를 시작하기 전에 인큐베이션 챔버와 현미경을 32 °C에서 ~1 - 2시간 동안 예열하세요.
   참고: 현미경 세팅에 따라 가열 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다. 예열은 드리프트를 줄이고 자동 초점 제어 시스템을 안정화하는 데 필수적입니다.
2. 현미경을 켜고 현미경 제어 소프트웨어를 시작하세요. 위상 대비 이미지뿐만 아니라 녹색 형광, 적색 형광, 노란색 형광 단백질의 이미지를 획득하기 위해 올바른 대물렌즈와 적절한 거울, 필터를 선택하세요.
   참고: 현미경은 일반적으로 현미경 제어 및 영상 획득을 위한 선호 소프트웨어가 함께 제공됩니다. 여기서는 현미경과 이미지 획득을 제어하기 위해 상업적으로 제공되는 소프트웨어(재료표 참조)를 사용했습니다.
3. 32 °C에서 사전 인큐베이션된 대물렌즈와 샘플 바닥에 고품질 침수유 한 방울을 추가하세요. 현미경 스테이지에 올릴 때 대물렌즈가 손상되지 않도록 대물렌즈를 가능한 한 낮은 Z 위치에 놓으세요. 금속 프레임과 시료를 현미경 스테이지 위에 올려놓고, '구멍 쪽'은 대물렌즈 쪽을 향하게 합니다. 샘플을 스테이지 홀더에 단단히 고정하세요.
4. 단계를 Z 방향으로 목표물에 더 가깝게 이동시켜 셀에 집중하세요. 오일이 샘플 바닥에 떨어지고 대물렌즈가 접촉할 때 스테이지를 천천히 움직입니다. 초점면에 셀이 있을 때 시야 영역에 여러 개의 단일 셀이 보일 때까지 스테이지를 X/Y 방향으로 이동시킵니다. 나중에 획득한 이미지를 정렬하기 위해 적어도 하나의 형광 미세구가 시야 영역에 있는지 확인하세요.
   참고: 최적의 조건에서는 시야 영역당 15-30개의 셀 밀도(2,048 x 2,048 픽셀 또는 133.1 x 133.1 μm)에 도달해야 합니다.
5. 현미경 제어 소프트웨어의 다차원 획득 마법사를 열어 타임랩스 실험을 설정하여 필요시 여러 파장과 스테이지 위치에서 이미지를 획득할 수 있습니다.
   1. 메인 탭에서 타임랩스 와 다중 파장을 활성화하세요. 창 왼쪽에 추가 탭이 나타납니다.
   2. 저장 탭을 클릭하고 디렉토리를 선택해 컴퓨터 하드 드라이브의 빈 폴더를 선택하여 획득한 이미지를 저장하세요. 파일이 존재한다면 연속된 데이터셋이 이전 데이터셋을 덮어쓰지 않도록 Increment base name을 활성화하세요. 그 다음 실험 이름과 날짜, 균주 이름 또는 실험 제목을 붙입니다.
   3. 타임 랩스 탭을 클릭하여 타임랩스 매개변수를 조정하세요. 지속 시간을 24시간으로 설정하고 시간 간격을 20분으로 설정하세요. 타임 포인트 수는 자동으로 변경됩니다.
      참고: 최적의 시간 간격은 실험과 분석할 세포 기능에 따라 달라집니다. 잦은 이미지 촬영은 광표백을 유발할 수 있습니다. 따라서 시간 해상도와 광표백 사이의 절충관계를 경험적으로 찾아야 합니다. 4-6시간의 두 배 시간 동안 위상 대비 현미경을 위해 5분 간격(또는 원한다면 더 짧은 간격)으로 쉽게 이미지를 획득할 수 있습니다. 24시간 동안 형광 현미경을 원할 경우, 약 15분에서 30분 간격으로 영상을 기록해야 합니다.
   4. 파장 탭을 클릭하세요. 각 시점에서 각 이미지에 대해 획득할 파장 수를 변경하여 선택하세요.
      참고: 각 파장마다 " 다차원 획득" 마법사 왼쪽에 새로운 탭이 나타나며, 파장은 위에서 아래까지의 순서대로 획득됩니다. 각 파장마다 획득 설정을 별도로 수정할 수 있습니다.
   5. 맨 위에서 첫 번째 파장 탭을 클릭하세요. 조명 드롭다운 목록에서 위상 차이를 선택하세요. 노출을 위해 100ms를 선택한 후 획득 드롭다운에서 모든 시점을 선택하세요. 드롭다운 목록에서 '절대 안 되는'을 선택해 자동 노출을 비활성화하세요.
   6. 각 시점에서 획득해야 할 파장마다 3.5.5단계를 반복합니다. 여기서 설명한 실험 설정과 형광 표지 단백질의 경우, 노출 기준은 다음과 같습니다 : mCherry 융합 단백질은 250ms, YFP(옐로우 형광 단백질) 융합 단백질은 200ms, GFP(녹색 형광 단백질) 융합 단백질은 1,000ms. ​
      참고: 각 균주와 형광 단백질에 대한 최적의 조명 설정은 사전에 각 파장별로 램프 세기와 영상 획득 시간을 변경하여 결정해야 합니다. 이미지 획득 시간이 너무 길면 광독성 효과가 증가하여 결국 성장 정체와 세포 사멸로 이어집니다. 따라서 이미지 품질과 세포 생존성 사이에서 절충이 이루어져야 합니다.
   7. 여러 단계 위치에서 이미지를 획득하여 같은 실험에서 기록되는 세포 수를 늘립니다.
      1. 여러 스테이지 위치에서 이미지를 획득하려면 메인 탭에서 멀티 스테이지 포지션을 활성화하세요. 그 다음 스테이지 탭을 클릭하고 라이브 버튼을 클릭하면 시야를 볼 수 있습니다.
      2. 스테이지를 X/Y 방향으로 이동시켜 관심 영역(ROI)이 시야에 들어올 때까지 진행합니다. 스테이지 탭에서 "+"를 클릭하여 X-와 Y 좌표를 저장하세요. 스테이지를 X/Y 방향으로 다시 이동시켜 새로운 ROI를 찾고, 좌표를 "+"를 눌러 저장하세요. 원하는 지역이 저장될 때까지 계속 진행하세요.
         참고: 형광 이미지 획득의 경우, 관심 영역(ROI)이 너무 가까이 있지 않아 광독성을 최소화해야 합니다.
6. 저장된 X-및 Y 위치를 클릭해 셀이 초점이 맞는지 다시 확인하고, 실험 내내 저장된 Z-위치를 일정하게 유지하기 위해 AFC 홀드 를 눌러 하드웨어 자동 초점을 시작하세요.
7. 현미경 제어 소프트웨어에서 다차원 획득 마법사의 획득을 클릭하여 타임랩스 녹화를 시작하세요.
   참고: 획득한 파장마다 하나의 창이 나타나고, 획득한 시간점의 수와 다음 사진 획득까지의 시간을 보여주는 추가 창이 나타납니다.
8. 타임랩스 녹화의 첫 몇 시간 지점 후에도 셀이 여전히 초점이 맞는지 확인하여 이미지 품질을 극대화하고 필요하다면 다시 초점을 맞추세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AFC와의 DMI6000B	라이카 마이크로시스템	11888945	적응형 초점 제어가 있는 자동 역광시야 형광 현미경
범용 장착 프레임	라이카 마이크로시스템	11532338	다양한 샘플 크기에 대한 스테이지 홀더(stage holder)
HCX PL 플루오타 100x/1.30 오일 PH3	라이카 마이크로시스템	11506197	위상 대물
오르카 플래시 4.0 카메라	하마마츠	11532952	4.0 메가픽셀 sCMOS 카메라 사진 촬영
필터 세트 TXR ET, k	라이카 마이크로시스템	11504170	형광 필터 세트, 예: 560/40 전자기: 645/75
필터 세트 L5 ET, k	라이카 마이크로시스템	11504166	형광 필터 세트, 예: 480/40 전자기: 527/30
필터 세트 YFP ET, k	라이카 마이크로시스템	11504165	형광 필터 세트, 예: 500/20 전자기: 535/30
프로스캔 III	프라이어	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	인터랙티브 제어 센터가 있는 현미경 자동화 컨트롤러
EL 6000 광원	라이카 마이크로시스템	11504115	외부 형광광원
인큐베이터 BLX 블랙	페콘	11532830	현미경을 둘러싼 검은색 인큐베이션 챔버
템컨트롤 37-2 디지털	라이카 마이크로시스템	11521719	인큐베이션 챔버용 자동 온도 제어
Filtropur BT25 0.2 병뚜껑 필터	사르스테트	831,822,101	완충제 멸균용 병뚜껑 필터
데크글레이저	VWR	630-1592	유리 커버 슬립 (60 x 22 mm, 두께: 0.7 mm)
Seakem LE 아가로스	론자	50004	현미경 슬라이드용 한쪽 농산물
라이카 메타모프 AF	라이카 마이크로시스템	11640901	현미경 제어 소프트웨어 및 사진 분석을 위한 소프트웨어
사막 미세스퍼, 0.5 μm	서모피셔	T7281	형광 미소구