Bdellovibrio bacteriovorus의 생세포 타임랩스 영상 대장균에 대한 포식

초록

출처: Makowski, Ł. 외 타임랩스 형광 현미경을 이용한 박테리아 포식자 Bdellovibrio bacteriovorus 의 생세포 영상. J. Vis. 경험 (2020)

이 영상은 아가로스 패드 아래 고정된 대장균을 포식하는 Bdellovibrio bacteriovorus의 타임랩스 형광 영상을 시연하여, 박테리아 포식 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 있어 세포 내 복제와 자손 방출을 실시간으로 시각화할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. 타임랩스 형광 현미경 도도

1. 35mm 접시를 페트리 접시 홀더에 넣어 실험 중 움직이지 않도록 하세요. 35mm 접시 하단과 대물렌즈 바닥에 1.518 굴절률의 침수 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.
2. 홀더를 현미경 챔버 내 역현미경 스테이지에 장착하세요.
3. 현미경 제어 소프트웨어에서 여러 단계 위치에서 여러 이미지를 시간에 걸쳐 수집할 수 있는 옵션을 설정하세요.
   1. 배율(100배)과 다색 렌즈(GFP(녹색 형광 단백질)/mCherry)를 설정하세요. 아이피스와 밝은 시야(BF)를 사용해 초점면을 찾아 포인트 리스트 매니저를 엽니다.
   2. 스테이지를 이동시키고 각 위치별 좌표를 미현경 소프트웨어의 마크 포인트 버튼을 클릭하여 최소 10개 이상의 위치를 선택하세요. 광표백과 광독성을 방지하기 위해 서로 가까운 위치를 피하세요. 카메라 밸브를 접안렌즈에서 모니터로 돌려 초점면을 설정한 후 포인트 리스트 매니저에서 '포인트 교체' 버튼을 클릭하여 각 포인트를 보정하세요.
   3. 실험 설계자를 열고 각 탭에서 모든 실험 매개변수를 다음과 같이 설정하세요:
      1. Z-스태킹 박스의 표시를 해제하세요.
      2. 형광 채널을 선택하고 최적의 조명 설정을 설정하세요. 여기서는 다음 설정들이 사용되었습니다: mCherry 채널, mCherry 필터 세트(EX575/25; EM625/45), 50% 강도, 200ms 노출 시간; GFP 채널의 경우 GFP 필터 세트(EX475/28; EM525/48), 50% 강도, 80 ms; BF 이미지는 POL 채널, 5% 강도, 50ms입니다.
      3. 이미지 획득 간격과 실험 전체 시간 사이의 간격을 선택하세요. 여기서는 실험 기간 10시간 동안 5분 간격으로 수행되었습니다.
      4. 선택한 위치에 초점 유지 기능을 활성화하세요(여기서 사용하는 시스템의 경우, UltimateFocus로 초점 유지 체크박스를 표시함).
      5. 이미지 파일이 자동으로 저장될 데이터 폴더를 선택하세요.
      6. 현미경 소프트웨어 제어에서 모든 설정을 다시 확인한 후 타임랩스 실험을 시작하세요.
4. 실험 첫 한 시간이 지나면 모든 스테이지 위치가 여전히 초점이 맞는지 확인하세요. 필요하다면 이미지 획득 사이의 시간 간격 동안 초점을 조정하세요.
5. 타임랩스 실험이 끝나면 페트리 접시를 제거하고 생물안전 프로토콜에 따라 35mm 안테나와 아가로스 패드를 사용하세요.
   참고: 1.2단계 이후의 모든 하위 단계는 델타비전 엘리트 사용자들을 위한 것입니다. 다른 시스템을 사용하는 연구자들은 개별 시스템에 맞게 설정을 조정해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인증된 분자생물학 아가로스	바이오-래드	161-3100	아가로스 패드용 저형광 아가로스
피지	이미지J	https://imagej.net/Fiji	오픈 소스 이미지 처리 패키지
유리 바닥 접시 35mm	이비디	81218-200	코팅되지 않은 유리
현미경	GE	델타비전 엘리트	마이크로타이터 스테이지, 얼티밋 포커스 레이저 모듈, DV Elite CoolSnap HQ2 카메라, SSI 조립 FP DV, 키트 obj. 올리 100x 오일 1.4 NA, 프리즘 노마스키 100x LWD DIC, ENV 컨트롤 IX71 uTiter opaQ 240 V
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