형광 영상을 통한 3차원 박테리아 단백질 분포 시각화

Abstract

출처: Bratton, B. P. 외, 『박테리아 세포의 3차원 영상 정밀 세포 표현과 단백질 위치 파악』. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 박테리아 세포의 3차원 형광 이미지를 획득하고 분석하여 단일 세포 수준에서 단백질 조직을 연구하는 방법을 시연합니다.

Protocol

1. 영상

1. 밀봉된 슬라이드를 현미경에 삽입하고 주변 온도와 균형을 맞추기 위해 5분간 두세요. 현미경실은 샘플 준비실과 온도가 다를 수 있습니다.
2. 샘플의 형광 Z-스택을 취합니다.
   참고: z-스택은 시추계 깊이보다 작은 z-간격으로 샘플을 완전히 덮어야 합니다. 1.45 NA 100x 대관렌즈와 ~1 μm 두께의 대장균 세포의 경우, 100 nm 간격으로 40단계로 진행하면 효과가 좋습니다. 더 큰 세포나 표면에 완전히 평평하지 않은 세포의 경우, 50단계 이상이 필요할 수 있습니다. 충분한 단계를 포함하고 샘플이 위아래 완전히 흐릿하게 처리되도록 하세요.
   1. 현미경과 연관된 소프트웨어( 재료표 참조)를 사용하여 현미경을 제어하세요.
   2. 현미경 초점 휠을 사용해 세포 중앙에 초점을 맞추세요. ND 획득 항목에서 Z 박스를 체크하여 z-스택을 취하세요. 홈 버튼을 눌러 셀의 중앙을 시작점으로 설정하세요. 스텝 크기를 0.1 μm으로 설정하고 범위는 4 μm으로 설정하세요. Z 장치가 압전 단계로 설정되어 있는지 확인하세요.
   3. 람다 창 아래 형광 채널을 영상 중인 형광 분자 설정으로 설정하세요. 이 실험에서는 GFP와 mCherry가 사용되었습니다.
      참고: 추가 형광 채널의 3D 분포를 원한다면, 두 번째 색상 채널에 동일한 스텝 크기와 범위의 z-스택을 추가로 가져가세요. 이 실험에서는 세포질 mCherry를 사용해 세포 형태를 결정했고, MreB-GFP를 두 번째 색상 채널로 사용했습니다.
   4. 실험 순서가 람다(z 시리즈)로 설정되어 각 색상 채널에서 완전한 z-스택을 수행하도록 하여 전환 전에 완료하세요.
   5. 이미지 획득을 시작하고 한쪽 또는 양쪽 z-스택이 완료되면 파일을 저장하려면 '지금 실행'을 클릭하세요.
   6. 패드의 새로운 영역으로 이동하고 1.2.2-1.2.5 단계를 반복하세요.

2. 세포 재구성

1. 개별 셀을 자르고 이미지는 stacked tiff 파일로 저장해서 파일당 셀이 하나만 되도록 하세요. 이 셀이 다른 셀과 잘 분리되어 있는지 확인하세요(즉, xy의 흐림 함수 전체 폭 절반값의 약 5배 정도).
   참고: 이는 무료로 제공되는 이미지 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 수행할 수 있습니다.
   1. 개별 셀 주위에 박스를 그려서 각 채널별로 두 번씩 복제하세요. 중복 하이퍼스택 박스가 체크되어 있는지 확인하고 채널을 1 또는 2로 변경하며, 슬라이스에 전체 z-스택이 포함되도록 하세요.
      참고: 세포의 형태만 촬영하고 추가 형광 단백질이 없다면 하나의 채널만 존재하게 됩니다.
   2. 두 스택이 모두 사용 가능해지면 이미지 | 서가 | 도구 | 단백질 채널과 이미지를 먼저 결합하고 두 번째로 형태 채널을 결합하도록 연결하세요.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아가로스	시그마-올드리치	A9539
면봉	퓨리탄 메디컬 프로덕츠 컴퍼니 LLC	S304659	VaLaP를 Appy 사용했습니다
표지 슬립	VWR	16004-302
피지	이미지J	https://fiji.sc	크로셀에 사용됨
라놀린	시그마-올드리치	L7387	파라핀과 바셀린젤과 결합해 VaLaP를 만듭니다
LB 성장 배지	BD 디프코	DF0446173
M63 중형	미국 생물학	M1015
MATLAB	수학 작품		컨볼루션 스크립트를 앞으로 실행해야 합니다
현미경 슬라이드	피셔	12-550-133
NIS 요소	은콘
파라핀	시그마-올드리치	327212
바셀린	이퀄트	49035-038-27
피에조 z 단계	니콘	77011589
피펫 팁 -p200	USA 사이언티픽	1111-0730
피펫 팁 - p10	USA 사이언티픽	1111-3730