비브리오 콜레라에 감염된 제브라피시의 장내 세균 부하 정량화

초록

출처: Nag, D. 외 성체 제브라피시 모델에서 비브리오 콜레라의 정화 및 설사. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 항생제 내성 콜레라균에 감염된 성체 제브라피시의 장내 세균 부하를 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 안락사 및 해부 후에는 장을 분리하고 유리 구슬로 균질화한 후 박테리아를 방출하기 위해 처리됩니다. 결과된 균질체는 선택적 배지에 플레이트되고, β-갈락토시다아제를 발현하는 파란색 콜로니를 세어 박테리아 부하를 추정합니다.

프로토콜

1. 장 내 정착 수준 결정

참고: 장 내 정착은 제브라피시 모델에서 가장 유용한 지표로, 다양한 콜레라 균주들의 상대적 적합도나 돌연변이 또는 유전자 결손의 효과를 비교할 수 있습니다.

1. 안락사

1. 실험이 원하는 종말에 도달하면, 감염수(보통 15mL 충분)를 채취하여 배설된 박테리아 수치와 설사(점액 분석, 단백질 함량, OD 등)를 측정할 수 있습니다.

2. 남은 물을 어망으로 (물고기를 모으기 위해) 표백제에 부어 물 속의 V. 콜레라를 죽입니다.

3. 물고기를 감염수와 336 μg/mL의 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설폰산염(트리카인)이 담긴 비커에 넣고, 이 트리카인 용액에 20분간 RT 양육시킵니다.
참고: 망사는 10% 표백제 용액으로 멸균되었습니다.

2. 해부

1. 생선 조리

1. 일회용 플라스틱 숟가락으로 트리카인 용액에서 생선을 떠서 해부 표면에 올려놓습니다.

2. 물고기의 배 쪽이 위를 향하게 하여 하턱을 통해 고정하고, 핀의 둔한 끝은 몸 중심에서 멀어지게 합니다. 항문 바로 뒤쪽, 역시 몸에서 멀어지도록 핀을 하나 더 꽂으세요.

2. 장관 노출

1. 70% 에탄올에 담근 보풀 없는 물티슈로 물의 배 표면을 닦아냅니다.

2. 메스와 바나스 가위를 70% 에탄올에 담근 후 불을 붙여 멸균한다.

3. 비늘을 관통하고 메스를 사용해 피부 바로 아래 배에 세로로 작은 절개를 한다. 장은 피부 바로 아래에 위치하므로 너무 깊게 절개하지 않도록 주의하세요.

4. 가위를 사용해 절개를 몸 전체를 따라 조심스럽게 확장하며, 피부 높이보다 깊지 않게 자르고 항문은 피합니다.

5. 가위로 물고기 머리 쪽으로 두 번 옆으로 잘라 절개 부위를 열어줍니다.

6. 측면 절개 양쪽 피부를 해부 표면에 고정하고, 핀을 몸에서 멀어지게 각도 내어 고정합니다.

참고: 핀 끝은 이전에 알코올로 불을 붙여 멸균한 상태였습니다.

3. 장 제거

참고: 장은 다른 장기 위에 창백하고 매우 가느다란 관처럼 보여야 합니다.

1. 소멸 후 전체 장관(보통 길이 12–15mm)을 제거한다. 장을 유리 구슬( 1.3.1–1.3.2 단계 참조)과 1x PBS 또는 LB 1mL가 들어 있는 균질화 튜브에 얼음 위에 넣습니다.

3. 균질 화

1. 균질화 튜브를 미리 준비하여 1mm 유리 구슬 ~1.5g을 2mL 나사 캡 튜브에 붓고(대략 절반 정도 채우기), 오토클레이핑으로 멸균합니다.

2. 멸균 LB 1mL 또는 PBS 1회 추가.

3. 제브라피시 장이 튜브에 추가된 후( 1.2.3.1단계), 캡을 아주 단단히 고정한 후 튜브를 보텍스 균질기에 고정합니다.

4. 최대 설정으로 1분간 균질화한 후 얼음에서 1–2분간 냉각합니다. 이 균질화 과정을 한 번 더 반복하면 완전한 균질화가 됩니다. 참고: 균질화를 위한 여러 대체 방법도 가능합니다.

4. 장 내 정착 수준 정량화

1. 균질액의 연속 희석을 위해 각 튜브에 900 μL LB 또는 1배 PBS를 첨가하여 튜브(소형 유리 시험관 또는 1.5 mL 마이크로 원심분리관)를 준비합니다. 각 물고기마다 5–6개의 튜브를 준비하고, 첫 번째 튜브에 100 μL의 균질물을 첨가한 뒤 혼합하기 위해 소용돌이로 섞은 뒤, 첫 번째 튜브에서 두 번째 튜브로 100 μL을 추가하여 장 균질류를 10배로 희석합니다.

2. 모든 희석액이 준비될 때까지 이 과정을 반복합니다.

3. LB 한천 판에 100–200 μL 희석액을 플레이트 부착하며, 스트렙토마이신 내성 균주 사용 시 100 μg/mL 스트렙토마이신과 40 μg/mL X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)을 포함합니다. 플레이트를 30°C에서 16–18시간 배양합니다.

4. 하룻밤 배양 후에는 자동 집체 계수기를 사용하거나 수동으로 집단을 세어 판에 V. 콜레라 군락을 세어; 집단을 표시하는 것이 마커 팁으로 유용합니다.

5. 플레이트 수에 현탁액의 희석 계수를 곱하여 피판된 부피를 고려하여 어류 장당 CFU를 산출합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
악기
셰이커 인큐베이터	뉴브런즈윅 사이언티픽, 에디슨, 뉴저지	엑셀라 E25
인큐베이터	뉴에어, 플리머스, 미네소타	자동 흐름
분광광도계	서모, 월섬, 매사추세츠	기어시스 6
와류 균질기	미니비드비터24	112011
무게 측정기	오하우스, 콜롬비아, 메릴랜드	어드벤처러 프로
열 교반기	코닝, 코닝, 뉴욕	PC-420D
버너
자동 식민지 카운터	REVSCI	120417B
재료
400ml 유리 비커	파이렉스
천공 뚜껑	팁 박스에서 구멍이 뚫린 마이크로팁 홀더
일회용 플라스틱 숟가락	오피스 디포, 플로리다주 보카 레이턴	D15-25-7008
어항 시스템	아쿠아니어링, 샌디에이고, 캘리포니아
RO 정수기	아쿠아 FX	TK001
어망	마리나
어류 먹이	테트라 지느러미
브라인 쉬림프	레드 정글 브랜드	O.S.I. 프로 80
스티로폼 보드
핀
메스	파인 사이언티픽 툴스, 포스터 시티, 캘리포니아	10000-10
겸자	파인 사이언티픽 툴스, 포스터 시티, 캘리포니아	11223-20
반나스 가위	파인 사이언티픽 툴스, 포스터 시티, 캘리포니아	15000-11
2ml 스크류 캡 튜브	피셔 사이언티픽, 햄프턴, NH	02-681-375
1mm 유리 구슬	생물 사양	11079110
스프레딩용 유리 구슬	시그마, 세인트루이스, 미주리	18406-500G
페트리 플레이트	피셔 브랜드, 햄프턴, NH	FB0875713
1.5ml 원심분리기 튜브	미드사이, 밸리 파크, 미주리	AVSS1700
50ml 원심분리기 튜브	코닝 팔콘, 코닝, 뉴욕	352098
시험관	파이렉스	9820
유리 피펫	피셔 브랜드, 햄프턴, NH	13675K
마이크로 피펫	사르토리우스 바이오힛, 괴팅겐, 독일	m1000/m200/m20
팁	제네시 사이언티픽, 샌디에이고, 캘리포니아	24-150RS/24-412
화학물질
즉석 해양 소금
인산염 완충 식염수	VWR 라이프 사이언스, 래드너, PA	K813-500ml
트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 소금	시그마, 세인트루이스, 미주리	A5040
LB 미디엄
나클	피셔 사이언티픽, 햄프턴, NH	BP358-212
아가르	BD 바이오사이언스, 샌호세, 캘리포니아	214010
TCBS 아가르	BD 바이오사이언스, 샌호세, 캘리포니아	265020
DCLS 아가르	시그마, 세인트루이스, 미주리	70135-500gm
소프트웨어
마이크로소프트 오피스
프리즘 5