성체 제브라피시에서 비브리오 콜레라에 의한 장 내 정착 및 설사 유도

초록

출처: 나그, D., et.al. 성체 제브라피시 모델에서 비브리오 콜레라의 정화 및 설사. J. Vis. 경험 (2018)

이 영상은 장내 정착과 질병 결과를 연구하기 위해 병원성 비브리오 콜레라 균주를 접종하는 성체 제브라피시를 시연합니다. 이 연구는 박테리아 독소가 장의 완전성을 방해하여 액체 누출, 점액 분비, 물성 설사를 유발하는 과정을 보여줍니다.

프로토콜

1. 제브라피시 접종 시 침수
   참고: 이 노출 방식은 감염의 자연스러운 경과와 유사합니다.
   1. 비브리오 콜레라 제제
      1. LB 플레이트에서 분리한 V. 콜레라 군락과 함께 5mL의 용화성 육수(LB)를 접종하고, 37°C에서 흔들며 180rpm 6–8시간 배양합니다.
      2. 250mL 원뿔형 플라스크에 25mL의 신선한 오토클레이드 LB 배지를 50 μL의 1박 배양액과 함께 접종합니다. 37°C에서 16–18시간 동안 진동(150rpm)을 부양합니다.
      3. 600nm(OD₆₀₀)에서 1/10 희석된 배양 배양액의 광학 밀도를 읽어 mL당 박테리아 수를 추정합니다(OD₆₀₀ = 1은 ~10⁹ CFU/mL입니다).
      4. 세포를 6,000g 원심분리로 10분간 수확하세요. 배지를 피펫으로 제거하거나 소독제 용액에 부어 버리세요. 세포를 무균 PBS에 재현탁하여 원하는 농도로, 일반적으로 PBS 1ml당 1 x 10^{7에서 1} x 10¹⁰ 사이입니다.
         참고: 여기서는 60 mg/L 해염을 포함한 역삼투압 오토클레이드 물을 멸균 감염수라고 부릅니다.
   2. 접종 및 배양
      1. 400mL 비커에 200mL의 멸균 감염수를 넣어 네다섯 마리의 제브라피시를 넣습니다.
      2. V . 콜레라 1mL를 200mL 감염수에 넣어 원하는 감염 농도(일반적으로 5 x 10,⁴ to 5 x 10,⁷ CFU/mL)를 얻습니다.
      3. 물고기가 튀어나오지 않도록 구멍이 뚫린 뚜껑으로 비이커를 덮으세요; 200 μL 팁 박스 상단이 이 용도로 잘 작동합니다.
      4. 각 비커에 라벨을 붙이고, 실험 기간 동안 28°C에 설치된 유리 앞 인큐베이터에 넣으세요.
   3. 일과성 노출 절차
      참고: V. 콜레라에 일시적으로 노출(보통 6시간)과 접종 박테리아를 제거하는 것은 전파 연구와 배설된 박테리아의 정량화에 유용합니다.
      1. 6시간 노출 후에는 비커 물을 피쉬 그물에 부어 물고기를 모으세요. 감염된 물을 표백제 용기에 버려 콜레라균을 죽이세요.
      2. 제거한 물고기를 멸균된 감염수 200mL 비커에 넣습니다. 물고기가 이 깨끗한 물에서 5분간 헤엄치도록 하여 표면에 있는 박테리아를 제거하세요.
      3. 그물 과정을 반복하고 200mL 멸균 감염수 비커에 물고기를 넣습니다. 실험 기간 동안 이 비커에 물고기를 보관하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
악기
인큐베이터	뉴에어, 플리머스, 미네소타	자동 흐름
재료
400ml 유리 비커	파이렉스
천공 뚜껑	팁 박스에서 구멍이 뚫린 마이크로팁 홀더
어항 시스템	아쿠아니어링, 샌디에이고, 캘리포니아
RO 정수기	아쿠아 FX	TK001
어망	마리나
어류 먹이	테트라 지느러미
페트리 플레이트	피셔 브랜드, 햄프턴, NH	FB0875713
1.5ml 원심분리기 튜브	미드사이, 밸리 파크, 미주리	AVSS1700
시험관	파이렉스	9820
마이크로 피펫	사르토리우스 바이오힛, 괴팅겐, 독일	m1000/m200/m20
팁	제네시 사이언티픽, 샌디에이고, 캘리포니아	24-150RS/24-412
LB 미디엄
트립톤	BD 바이오사이언스, 샌호세, 캘리포니아	211705
효모 추출물	BD 바이오사이언스, 샌호세, 캘리포니아	212750
나클	피셔 사이언티픽, 햄프턴, NH	BP358-212
아가르	BD 바이오사이언스, 샌호세, 캘리포니아	214010