세균 노출 후 C. elegans 의 장 투과성 평가

초록

출처: Le, T. A. N . 외, 박테리아 및 화학물질이 카 에노르하브디티스 엘레간스의 장 투과성에 미치는 영향 측정. J. Vis. 경험 (2019)

이 영상은 Pseudomonas aeruginosa에 노출된 C. elegans의 장 투과성을 정량화하기 위한 형광 기반 분석 방식을 보여줍니다. 대장균을 먹인 대조군과 비교하면, 병원체 처리된 벌레는 체강으로의 형광체 누출이 증가하여 상피 장벽 손상을 나타냅니다.

프로토콜

1. 선충 성장 배지(NGM) 플레이트 제작, 다양한 박테리아가 Caenorhabditis elegans(C. elegans)의 장 투과성에 미치는 영향을 시험하기 위해

1. 500mL 유리병에 펩톤 1.25g, NaCl 1.5g, 한천 8.5g, 자기 교반기, 증류수 487.5mL를 넣습니다.
2. 혼합물을 잘 섞고, 121 °C에서 15분간 오토클레이브한 뒤, 55 °C로 물욕에서 30분간 식힙니다.
3. 배지를 수욕에서 꺼내고, 각 성분들(1 M CaCl₂ 0.5 mL, 콜레스테롤 0.5 mL, MgSO₄ 0.5 mL, KPO₄ 12.5 mL)을 NGM에 넣고 잘 섞습니다.
   참고: 콜레스테롤(절대 에탄올에 용해됨)을 제외한 모든 개별 성분은 오토클레이션되어야 하며, 모든 실험 단계는 깨끗한 작업대에서 수행되어야 합니다.
4. 각 90 x 15mm 양양 접시에 20mL의 NGM을 분포하고, 한천을 상온(약 20°C)에서 깨끗한 작업대에서 굳히도록 합니다. NGM 플레이트는 4°C에서 최대 한 달간 보관할 수 있습니다.
   참고: 여기서 프로토콜을 잠시 멈출 수 있습니다. FITC-덱스트란(Fluorescein isothiocianate-dextran) 염색에 사용된 NGM 플레이트가 준비되었습니다. 각 60 x 15mm 페트리 접시에 10mL의 NGM을 분배하고, 상온(약 20°C)의 깨끗한 작업대에서 고체화되도록 했습니다.
5. 4 °C 냉장고에서 박테리아 배양물을 꺼내 배양물을 완전히 소용돌이로 돌리다가 NGM 플레이트에 발판합니다.
6. 각 신선한 NGM 플레이트에 총 800μL의 박테리아 배양물을 추가하고, 플레이트를 20 °C 인큐베이터에서 하룻밤 건조시킵니다.
   참고: 첫 번째 실험(그림 1)에서는 대 장균 OP50이 포함된 NGM 플레이트 2점, P. aeruginosa PAO1이 포함된 NGM 플레이트 1점, E. faecalis KCTC3206가 포함된 NGM 플레이트 1점이 준비되었습니다. 두 번째 실험(그림 2)에서는 생 대장균 OP50이 포함된 NGM 플레이트 2점, 생 P. aeruginosa PAO1이 포함된 NGM 플레이트 1점, 열로 비활성화된 P. aeruginosa PAO1이 포함된 NGM 플레이트 1점이 준비되었습니다.

3. 연령에 맞춰 조성된 C. elegans

1. 고체 NGM 판에서 벌레를 키우고 원하는 개체군에 도달할 때까지 대 장균 OP50으로 먹입니다.
2. 타이밍 산란법이나 표백액 처리법을 사용해 알을 동기화합니다

4. 박테리아 치료 및 FITC-덱스트란 섭식

1. 연령 동기화된 알은 NGM 플레이트에서 64시간 동안 부화시키고, 생 대장 균 OP50을 먹이로 보충합니다.
2. 나이에 맞춰 동기화된 L4 유충을 S-버퍼로 세척한 후, 약 500마리 이상의 벌레를 다양한 박테리아와 화학물질이 포함된 처리 NGM 플레이트로 옮깁니다. 20°C에서 48시간 동안 배화하세요.
   참고: 치료 시간은 사용되는 박테리아와 화학물질에 따라 24시간에서 72시간 사이일 수 있습니다. DIM의 치료 또는 예방 효과는 병원체로 구충을 미리 치료한 후 DIM으로 치료하는 방법으로도 평가할 수 있습니다(치료 효과), 또는 DIM으로 선처리한 후 병원체로 치료하는 방법으로도 평가할 수 있습니다(예방 효과).
3. FITC-덱스트란 보조판을 준비하기 위해, 열 비활성화된 대장균 OP50 2mL와 FITC-덱스트란 4mg을 혼합합니다. 그 다음 FITC-덱스트란과 대장균 OP50 혼합물 100 μL을 20개의 신선한 NGM 한천 플레이트(60mm x 15 mm)에 나누어 깨끗한 작업대에서 1시간 건조시킵니다.
   참고: 각 NGM 플레이트의 FITC-덱스트란 최종 농도는 20 μg/mL입니다.
4. 차량 대제 치료를 위해 FITC-덱스트란 없이 대 장균 OP50 함유 NGM 플레이트 5장을 준비합니다. 이를 위해 100 μL 열로 불활성화된 대장균 OP50을 각 신선한 NGM 한천 플레이트(60 mm x 15 mm)에 나누어 깨끗한 작업대에서 1시간 건조시킵니다.
   참고: 각 독립 실험마다 FITC-덱스트란 보조 NGM 플레이트 15개와 FITC-덱스트란이 없는 NGM 플레이트 5개가 필요합니다.
5. 48시간 후(7.2단계부터) S-버퍼로 벌레를 세척하고, FITC-덱스트란 보조판과 FITC-덱스트란 없는 NGM 판으로 이송한 뒤, 판을 하룻밤(14–15시간) 배양합니다.
   참고: 각 처리군마다 FITC-덱스트란 염색(또는 차량 대조군 급입)의 5회 복제가 필요합니다.
6. 지렁이를 S-버퍼로 세척하고 신선한 NGM 한천 플레이트에서 1시간 동안 기어 다니게 하세요.
   참고: 각 독립 실험마다 총 20개의 신선한 NGM 플레이트가 필요합니다. 이 단계에서는 NGM 플레이트를 대 장균 OP50과 함께 또는 사용하지 않고 보충할 수 있습니다.
7. 검은색 96웰 평바닥판의 각 웰에 4% 포름알데히드 용액 50 μL을 첨가합니다. 각 NGM 플레이트에서 약 50개의 웜을 각 웰로 옮겨 형광 측정을 합니다. 1분에서 2분 후, 각 웰의 포름알데히드를 모두 제거하고 100 μL 마운팅 매개체를 추가해 웰을 코팅합니다.
   참고: 포름알데히드 용액(4%)이 벌레를 고정하고 고정하는 데 사용됩니다. 각 처리 그룹에 대해 이미지 분석에 5개의 웰(5개의 복제)이 사용됩니다.

5. 오페레타 영상 시스템을 이용한 C. elegans 영상 및 FITC-덱스트란 형광 흡수 측정을 통한 장 투과성 측정

참고: 형광 입체현미경은 오페레타 시스템 대신 이미지 분석에 사용할 수 있습니다.

1. Operetta 고함량 영상 시스템을 사용해 형광 이미지를 촬영하고 형광 강도를 측정한 후 Harmony 소프트웨어로 이미지를 분석합니다.
2. Harmony 소프트웨어에서 뚜 껑 열 기 아이콘을 눌러 뚜껑을 열고 플레이트를 기계에 넣으세요.
3. 매개변수를 설정하세요.
4. 설정을 클릭하고 플레이트 유형(96웰 코닝 플랫 바텀)을 선택한 후 채널(밝은 필드 채널과 EGFP 채널)을 추가하세요.
5. 레이아웃을 조정하세요. 레이아웃 선택으로 가서 Track 을 선택하고 매개변수를 조정하세요(첫 번째 사진은 1 μm, 비행기 수는 10, 거리는 1 μm).
6. 처리 우물 중 하나와 캡처 필드 하나를 선택한 후 테스트 버튼을 눌러 실험 실행 섹션에서 사진이 만족스러운지 확인하세요.
7. 사진이 만족스럽다면 설정 섹션으로 돌아가 화면 끝의 리셋 아이콘을 누르세요. 그 후 모든 목표 유정과 적절한 수의 포획 필드를 선택합니다.
8. 다시 실험 실행 에 들어가서 플레이트 이름을 입력한 뒤, 시작 버튼을 눌러 처리를 시작하세요.
9. 형광의 강도를 측정하려면 이미지 분석 섹션으로 가서 이미지를 입력하세요. EGFP(강화 녹색 형광 단백질) 채널과 방법 B를 선택하여 세포를 찾으세요. 공통 임계값을 0.5, 면적을 >200 μm², 분할 인자를 3.0, 개별 임계값을 0.18, 대조제를 0.18 이상으로 조정합니다. 그 다음, 강도 특성을 계산하고 평균을 출력으로 선택합니다. 설정을 저장하려면 적용 아이콘을 누르세요.
10. 평가 섹션으로 가서 강도를 측정하려면 히트맵과 데이터 테이블을 얻으세요. Readout 매개변수를 셀 — 강도 셀, EGFP 평균 — 우물당 평균으로 설정하고 평가를 시작하세요.
    참고: 여기서 프로토콜을 잠시 멈출 수 있습니다.
11. 오페레타에서 데이터를 추출하려면 설정 버튼을 클릭하고 데이터 관리를 선택하세요.
12. Write archive를 선택한 후 탐색 기능을 열고 파일을 선택하세요.
13. 파일을 선택하려면 왼쪽 모서리의 작은 + 신호를 클릭한 후 측정을 클릭한 후 플레이트 이름을 선택하세요.
14. 파일을 선택하고 확인을 클릭하세요.
15. 활성 경로에서 탐색 신호를 클릭하여 파일을 저장할 경로를 선택하세요.
16. 데이터 파일을 저장하려면 시작 을 클릭하세요.
    참고: 여기서 프로토콜을 잠시 멈출 수 있습니다.

결과

그림 1: C. elegans의 장 투과성에 미치는 다양한 박테리아의 영향. 밝은 영역, FITC 형광(녹색 채널), 병합 이미지를 포함한 벌레의 현미경 이미지. FITC-덱스트란 섭취 없이 섭취한 (A) 대장균 OP50, (B) FITC-덱스트란 섭취를 한 대장균, (C...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
90×15mm 페트리 접시	SPL 라이프 사이언스, 대한민국	10090
60×15 mm 페트리 접시	SPL 라이프 사이언스, 대한민국	10060
박터 아가르	벡턴 딕킨슨	참고 문헌 214010
포름알데히드 용액	시그마	F1635
뇌 심장 주입술(BHI)	벡턴 디킨슨	참고문헌 237500
카에노르합디티스 엘레간스 N2	카에노랍디티스 유전학 센터(CGC)		야생형
코스타 검사 플레이트, 96 웰 블랙, 투명하고 평평한 바닥, 처리되지 않은 폴리스티렌	코닝 주식회사	참고문헌 3631
대장균 OP50	카에노랍디티스 유전학 센터(CGC)
플루오레세인 이소티오시아네이트 - 덱스트란	시그마	FD10
하모니 소프트웨어	퍼킨엘머		버슨 3.5
루리아-베르타니 LB 미디엄	머크	VM743185 626 1.10285.5000
황산마그네슘 헵타하이드레이트	피셔 바이오리에이전트	BP2213-1
플루오로마운트 수성 마운팅 배지	시그마	F4680
오페레타 CLS 고콘텐츠 분석 시스템	퍼킨엘머	HH16000000
펩톤	머크	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa(슈도모나스 아에루기노사) PA01	서체 문화를 위한 한국 컬렉션	KCTC 번호 1637
염화나트륨	피셔 바이오리에이전트	BP358-1
입체 현미경	니콘, 일본	SMZ800N
효모 추출물	벡턴 디킨슨	참고문헌 212750