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동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마우스 구강 개베지를 위한 살모넬라 티피무리움 ΔAroA 배양 준비
- 냉동 글리세롤 S . Typhimurium ΔAroA 재고에서 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함한 루리아-베르타니 한천(LB 한천)과 멸균 접종 루프를 사용한 줄무늬 플레이트를 만듭니다. 37°C에서 하룻밤 배양하세요. 스트릭 플레이트는 4°C에서 최대 일주일간 보관할 수 있습니다.
- 감염 하루 전, 0.5g 스트렙토마이신을 2.5mL 물에 녹여 항생제를 준비하세요. 스트렙토마이신 용액을 여과하여 멸균한 후, 벌브 팁이 달린 22G 개비지 바늘과 100 μL 스트렙토마이신 용액(20mg/용량)을 사용한 1mL 주사기로 쥐를 경구로 개베게합니다. 접종 루프를 사용하여 단일 콜로니가 있는 배양관에 3mL의 LB 육수(50 μg/mL 스트렙토마이신)를 접종합니다. 살모넬라 배양물을 37°C에서 200회전/분(RPM)으로 진동시키며 하룻밤 동안 유산소 배양합니다.
- 감염 당일에는 멸균 인산염 완충식염수(PBS)에서 2차례 연속으로 1/10 희석 살 모넬라 배양을 하여 최종 감염 투여를 준비합니다. 이로 인해 약 3 x 106 콜로니 형성 유닛(CFU)이 포함된 100 μL 접종체가 생성됩니다.
- 벌브 팁이 달린 22G 가베지 바늘과 1mL 주사기를 사용해 각 마우스에게 준비된 살모넬라 100 μL을 가베지합니다.
참고: 살모넬라 배양물을 무균 기법으로 준비하세요. 살모넬라의 최종 접종 농도는 LB 한천에 스트렙토마이신으로 연속 희석된 분량을 플래팅하여 확인할 수 있습니다.
2. 조직 내 살모넬라 부하 평가
- 2mL 안전 잠금장치, 둥근 바닥 마이크로튜브에 1mL 멸균 PBS와 오토클레이브 스테인리스 스틸 비즈를 준비하세요. 조직 채취 전에 튜브 무게를 미리 재세요.
- 이산화탄소 노출로 안락사된 쥐의 맹장과 비장 조직을 적절 제거하세요. 개별 동물의 조직을 별도의 관에 담아 채취하세요. 조직 무게를 확인하기 위해 튜브 무게를 재세요.
- 믹서 밀 장치를 사용해 30Hz에서 15분간 균질화합니다. 96웰 2mL 메가 블록에 웰당 900μL의 PBS를 전송합니다. 첫 번째 웰에 100 μL 조직 균질물을 피펫 주입한 후 잘 혼합한 후, 이후 웰에 100 μL을 추가하여 10⁻⁶ 희석을 얻을 때까지 연속 희석을 수행합니다. 10 μL씩 3중산액으로 희석된 각 10 μL을 LB 한천에 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유합니다.
- 1000 μL 샘플 중 10 μL을 도금하고 적절한 희석 계수를 설정한 이후, 평균 CFU를 100배로 곱하는 것이 중요합니다. 조직 총 CFU를 조직 무게로 나누어 조직 무게당 CFU를 구합니다.
참고: 조직 처리 중에는 모든 샘플을 얼음 보관 또는 4 °C 온도로 보관하세요. 조직 균질체로 연속 희석을 수행할 때는 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하세요. PBS를 담은 96웰 메가블록을 미리 준비하세요.