쥐 공동 감염 모델에서 박테리아 열거를 위한 감염 조직 처리

Abstract

출처: Lenhard A. 외. 바이러스 공동 감염 시 폐 렴 구균이 집착자에서 병원체로 전환되는 마우스 모델은 연령에 따른 악화된 질병을 재현합니다. J. Vis. 경험 (2022)

이 영상은 병원성 박테리아와 바이러스에 공동 감염된 쥐의 폐 처리 과정을 보여줍니다. 폐 조직을 다지고 균질화하며 플레이트링을 하면 박테리아 부하를 정량화하여 폐로의 박테리아 확산과 질병의 심각도를 알 수 있습니다.

Protocol

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 박테리아 개체 수를 위한 감염 조직 처리

1. 폐 수집
   1. 해부 가위를 사용해 노출된 갈비뼈 옆면을 잘라내고 갈비뼈를 부드럽게 쥐 머리 쪽으로 당겨 심장을 드러냅니다. 25G 바늘을 인산염 완충 식염수(PBS)가 미리 채워진 10mL 주사기에 부착한 후 천천히 주입을 시작하세요. 성공적인 관류의 지표로 폐의 백백을 확인하세요. 폐 조직이 손상되지 않도록 천천히 세척하세요.
   2. 겸자로 심장을 들어 올려 폐와 심장을 분리하는 절개를 하세요. 분리 후에는 겸자로 폐의 모든 엽을 채취하고, 멸균 PBS로 잔류 혈액을 제거하기 위해 그릇에 헹군습니다. 페트리 접시에서 폐를 작게 잘게 썰어 잘 섞으세요. 폐 혼합액의 절반을 제거하여 박테리아 군락형성 단위(CFU) 또는 바이러스 플라크 형성 단위(PFU)를 결정하고, 0.5mL PBS가 미리 채워진 둥근 바닥 15mL 튜브에 균질화를 위해 넣습니다.
      참고: 여러 평가를 위해 같은 폐의 다른 엽을 가져가지 않는 것이 중요합니다. 대신 모든 로브를 잘게 썰어 잘 섞어 서로 다른 평가에 맞게 균등하게 분리해야 합니다.
2. 수집된 조직을 균질화하려면, 먼저 균질제 프로브를 70% 에탄올에 넣고 60% 출력으로 30초간 가동하여 균질제이저를 세척합니다. 멸균된 물에서 10초간 이 과정을 반복합니다. 각 조직을 1분간 균질화하세요. 균질제 프로브를 각 샘플 사이 멸균수로 세척하고, 각 장기와 샘플군 사이에 70% 에탄올이 담긴 신선한 튜브에서 세척하세요.
3. 박테리아 수 열거
   1. 모든 장기가 채취되어 균질화되면, 혈액 한천 플레이트에 연속 희석액을 배제합니다. 총 CFU를 계산하려면 10 μL를 사용해 도판하고 각 샘플의 최종 부피(mL)를 기록합니다. 37°C/5%_CO2에서 하룻밤 배큐하세요.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD 일회용 주사기, 루어록 팁 (1 mL)	피셔	14-823-30
피셔브랜드 섬세한 해부 가위	피셔	08-951-5	수확에 사용되는 기구
피셔브랜드 박리 조직 겸자	피셔	13-812-38	적출을 위한 겸자
피셔브랜드 멸균 주사기 일회용 (10mL)	피셔	14-955-459