숙주-병원체 상호작용을 연구하기 위한 장벽 기능을 가진 인간 대장층 단층 생성

Abstract

출처: 인, J. G. 외. 병원체, 공존체, 숙주 장 상피 간 상호작용을 연구하기 위한 인간 대장장 단층. J. Vis. 경험 (2019).

이 영상은 콜라겐 코팅된 Transwell 시스템에서 대장유래 상피세포를 배양하여 장벽을 모델링하고 숙주-병원체 상호작용 연구를 가능하게 하는 점액 생성 단일층을 생성하는 절차를 시연합니다.

Protocol

1. 장장/대장부 현탁액 판금

1. 코팅된 삽입물이 4°C에 보관된 경우, 세포 플레이트 전 최소 30분 동안 37°C/5%_CO-2 조직 배양 인큐베이터에서 평형 상태로 유지해야 합니다.
2. 각 인서트를 도판할 때, 1mL의 따뜻한 증폭 배지(25-37 °C 사이)를 준비하고, 10 μM Y-27632와 10 μM CHIR 99021을 첨가합니다.
   참고: EM은 Advanced DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) /F12 포함 B27(1x), 50% WNT3A 조절 배지, 15% RSPO1 조절 배지, 10% Noggin 조절 배지, 50 ng/mL 인간 EGF(표피 성장 인자), 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, 항생제/항진균제 혼합물(1x), 10 mM HEPES (N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산))로 구성되어 있습니다. L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드(1배), 페니실린-스트렙토마이신(1배) (재료 표 참조).
3. 세포 펠릿이 담긴 튜브에서 세척 배지를 흡입한 후, 최소 100 μL/삽입물을 얻을 수 있는 EM 부피에 재현탁합니다.
4. 각 인서트에서 콜라겐 IV 용액을 흡인하고, 각 인서트마다 150 μL 세척 매체로 두 번 세척합니다.
5. 각 삽입물 아래 공간에 600 μL의 전자기(EM)를 피펫으로 주입합니다.
6. 각 삽입물에 100 μL 세포 현탁액을 피펫 주입합니다.
7. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣고 최소 12시간 이상 건드리지 않고 두세요.
   참고: 삽입막 내 대장막 조각의 불균등한 분포를 방지하기 위해 플레이트를 흔들거나 급격히 기울이지 마세요.
8. 2.5x-10배 대물렌즈 아래 위상 대비 광학 현미경에 판을 올려 세포 부착과 확산을 모니터링하여 융합 단색층을 형성하는 과정을 관찰합니다.
9. 1-2일 후에는 대부분의 조각이 콜라겐 매트릭스에 부착됩니다. 배양지를 새로 교체하고 Y-27632와 CHIR 99021 처리를 중단하세요. 매체를 2-3일마다 계속 리프레시하여 합류할 때까지 유지하세요. 합류는 일반적으로 7-10일 내에 도달합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올	시그마	T4661	트리스 베이스, 용해 버퍼의 구성 성분
A-83-01	토크리스	2939	ALK4/5/7 억제제
아세트산, 빙하산	피셔 사이언티브	A38
고급 DMEM/F12	라이프 테크놀로지	12634-010	성장 배지의 구성 요소
항생제/항진균제 혼합 요법	인비보젠	ANT-PM-2	프리모신 (100배)
B27, 50배	라이프 테크놀로지	17504-044	성장 배지의 구성 요소
세포 배양 삽입물	코닝	3470	트랜스웰, PET 멤브레인, 0.4 μm 기공, 24웰 플레이트
CHIR 99021	토크리스	4423	GSK3β 억제제
인간 태반에서 추출한 콜라겐 IV	시그마	C5533
컬트렉스 오르가노이드 수확 솔루션	트레비겐	3700-100-01	저저막 매트릭스를 탈중합합니다
에탄올, 절대	파르코	111000200
글루타맥스	라이프 테크놀로지	35050-061	L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, 200 mM
HEK293T/Noggin-Fc 세포주	반 덴 브링크 연구소, 티트갓 간 및 장 연구소		노긴 컨디셔닝 매체 생산을 위해
HEK293T/RSPO1-Fc-HA 세포주	트레비겐	3710-001-K	Rspondin-1 조건화 매질 생산을 위해
HEPES, 1 M	라이프 테크놀로지	15630-080	성장 배지의 구성 요소
인간 표피 성장인자(EGF)	연구개발 시스템	236-EG-01M	성장 배지의 구성 요소
역방향 세포 배양 광선현미경	올림포스	CKX51
L-WNT3A 세포주	ATCC	CRL-2647	Wnt3a 조건 배지 생산을 위해
마트리젤, 성장인자 감소	코닝	356231	3D 배양용 저저막 매트릭스
미니 셀 스크레이퍼	유나이티드 바이오시스템즈	MCS-200
MUC2 항체, 마우스 단클론	앱캠	AB11197	면역 염색은 1:100, 면역 블롯은 1:500으로 사용하세요
MUC2 shRNA 렌티바이러스 입자	GE 다르마콘	RHS4531	GIPZ 렌티바이러스 shRNA, ID: 4583
궤도 셰이커	그랜트 악기	PSU-10i
페니실린-스트렙토마이신, 100번	라이프 테크놀로지	15140-122	성장 배지의 구성 요소
마이크로팁이 장착된 프로브 소닉케이터	브랜슨 초음파	450
포유류 세포용 프로테아제 억제제 조합	시그마	P8340	용해 완충제의 구성 요소
SB 202190	토크리스	1264	p38 MAPK 억제제
염화나트륨	시그마	S3014	용해 완충제의 구성 요소
덱소이콜레이트 나트륨	시그마	D6750	용해 완충제의 구성 요소
도데실 황산나트륨	시그마	L3771	용해 완충제의 구성 요소
트립LE 익스프레스, 1회	라이프 테크놀로지	12605-010	트립신, 장내/대장 조각 소화를 위한 성분
빈쿨린 항체, 토끼 단클론	앱캠	AB129002	면역 블롯 시 1:1000 사용
물, 조직 배양 등급, 멸균 여과	코닝	25-055
Y-27632	토크리스	1254	RhoA/ROCK 억제제