1. 용액 준비
참고: 대 장균 (E. coli) 구상체를 생성하려면 1.1–1.9 단계에 설명된 용액을 준비하세요
- 10.34g 트리시메틸 HCl과 4.17g의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris·OH)을 125mL 플라스크 내 증류수(dH₂O)에 녹여 10.34 g 트리시메틸 아미노메탄(Tris·Cl, pH 7.8)을 제조합니다. 0.2 μm 막이 있는 25mm 주사기 필터로 여과하여 실온에서 원뿔형 튜브에 보관하여 멸균합니다.
- 용액 A(20 mM 염화마그네슘 클라이드(MgCl₂), 0.7 M 자당, 10 mM 트리스-클로스, pH 7.8)를 25 mL dH₂O에 녹여 125 mL 플라스크에 용해하여 준비합니다. 500 μL 1 M 트리스-클(pH 7.8)을 추가하고 부피를 50 mL로 조절합니다. 0.2 μm 막이 있는 25mm 주사기 필터로 여과하여 실온에서 원뿔형 튜브에 보관하여 멸균합니다.
- 용액 B(10 mM MgCl₂, 0.8 M 자당, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8)를 125 mL 플라스크에 25 mL dH₂O에 녹여 제조합니다. 500 μL 1 M 트리스-클(pH 7.8)을 추가하고 부피를 50 mL로 조절합니다. 0.2 μm 막이 있는 25mm 주사기 필터로 여과하여 실온에서 원뿔형 튜브에 보관하여 멸균합니다.
- 125mL 플라스크에 13.69g 자당(342.3 g/mol)을 50 mL dH₂O에 녹여 0.8 M 자당을 준비합니다. 0.2 μm 막이 있는 25mm 주사기 필터로 여과하여 실온에서 원뿔형 튜브에 보관하여 멸균합니다.
- 50mL 플라스크에 3mL dH₂O를 용해하여 5 mg/mL 디옥시리보뉴클레아제 I(DNase I)를 준비합니다. 0.2 μm 두께의 막이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하세요. 마이크로퓨지 튜브에 용액을 분리하여 −20 °C에서 저장합니다.
- 0.125 M 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA, pH 8.0)을 125mL 플라스크에 0.698 g EDTA 이산화나트륨 이물화물(372.2 g/mol)을 15 mL dH₂O에 녹여 준비합니다. 0.2 μm 막이 있는 25mm 주사기 필터로 여과하여 실온에서 원뿔형 튜브에 보관하여 멸균합니다.
- 125mL 플라스크에 세팔렉신 하이드레이트 0.03g(365.404 g/mol)을 50mL dH₂O에 용해하여 600 μg/mL 세팔렉신을 제조합니다. 0.2 μm 두께의 막이 있는 25mm 주사기 필터로 여과하여 4°C의 원뿔형 튜브에 보관하여 멸균합니다.
- 50 mL 플라스크에 3 mL dH₂O에 0.015 g 라이소자임을 녹여 5 mg/mL 라이소자임을 준비합니다. 0.2 μm 두께의 막이 있는 25mm 주사기 필터를 통해 여과하여 멸균하세요. 마이크로퓨지 튜브에 용액을 분리하여 −20 °C에서 저장합니다.
- 3% 트립티카제 대두 육수(TSB)를 2L 플라스크에 1L의 dH₂O에 녹여 3% 트립티카제 대두 육수(TSB)를 준비합니다. 용액을 각각 25 mL 또는 100 mL TSB가 들어 있는 플라스크에 알리코엇하여 E. coli 스페로플라스트 또는 B. megaterium 원형체를 제조하는 데 사용됩니다. 오토클레이브 플라스크로 액체 매체를 멸균합니다. 멸균 TSB는 실온 또는 4 °C 중 어느 쪽이든 보관할 수 있습니다.
- 용액 C(1 M 자당, 0.04 M 말레산염, 0.04 M MgCl₂, pH 6.5)를 250 mL 플라스크에 100 mL dH₂O 100 mL에 녹여 제조합니다. pH를 6.5로 조절하세요. 0.2 μm 막이 있는 25mm 주사기 필터로 여과하여 실온에서 원뿔형 튜브에 보관하여 멸균합니다.
2. 야간 배양 준비
참고: 2-3구간은 적절한 멸균 기법을 사용하여 수행하세요. 원한다면, 박테리아 균주에 항생제 내성을 위한 플라스미드가 포함되어 오염 가능성을 줄일 수 있습니다. 항생제 내성이 있는 품종을 사용할 경우, 2.1단계와 3.1–3.2단계에 필요한 항생제를 추가하세요.
- 멸균 피펫 팁을 사용해 단일 박테리아 군락을 골라 14mL 배양관에 3% w/v TSB가 포함된 2–3mL 배양관에 넣어 하룻밤 배양을 준비합니다. 37°C에서 16–21시간 동안 진동시키며 배양합니다.
3. 그람 음성 대장균 스페로플라스트 제제
- 250 mL 플라스크에서 25 mL 부피의 3% w/v TSB에 1:100 비율로 하룻밤 배양물을 희석하고, 37 °C에서 약 2.5시간 동안 진동시키며 600 nm에서 용액이 0.5–0.8의 광학 밀도에 도달할 때까지 배양합니다. 분광광도계를 사용해 광학 밀도를 측정하세요.
- 250 mL 플라스크에서 이 배양물을 30 mL 3% w/v TSB에 1:10 비율로 희석한 후 37 °C에서 배큐하고, 60 μg/mL 세팔렉신(347.4 g/mol) 존재 상태에서 2.5시간 동안 진동시켜 약 50–150 μm 길이의 단일 세포 필라멘트를 생성하는데, 이는 광학 현미경으로 1,000배 배율로 관찰됩니다(그림 1B).
- 박테리아 용액을 1,500 x g, 4 °C에서 4분간 원심분리하여 필라멘트를 수확합니다. 상원액을 디캔트하고 버리고, 펠릿은 남겨둡니다.
- 필라멘트를 세척할 때 0.8M 자당 1mL를 부드럽게 넣으면서도 펠릿을 건드리지 않도록 주의하세요. 1분간 배양한 후 펠릿을 흐트러뜨리지 않고 상청액을 버리세요.
- 150 μL 1 M 트리스-클(pH 7.8), 120 μL 5 mg/mL 라이소자임, 30 μL 5 mg/mL DNase I 30 μL, 0.125 M EDTA 120 μL 120 μL을 각 순서대로 페를렛에 첨가하고 상온에서 10분간 배큐합니다.
- 1mL 용액 A를 3.5 용액에 1분 정도 천천히 첨가한 후 마이크로피펫을 사용해 손으로 부드럽게 휘저으며 첨가합니다. 용액을 실온에서 4분간 배양하세요.
- 4 °C 용액 B 7 mL를 두 개의 15 mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 3.6 용량으로 준비한 용액을 이 두 튜브 각각에 같은 양의 양 첨가합니다. 용액을 1,500 x g, 4 °C에서 4분간 원심분리합니다.
- 혈청학적 피펫을 사용해 펠릿을 손상시키지 않고 1-2mL를 제외한 모든 상원액을 조심스럽게 제거하세요. P1000 마이크로피펫을 사용해 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 현지하세요. 광학 현미경으로 1,000배 배율로 샘플을 관찰하여 구상체 형성을 육안으로 확인해 보세요(그림 1C).
- 스페로플라스트는 -20°C에서 최대 일주일 또는 3번의 동결-해동 사이클을 거칠 때까지 보관하세요.
