병원성 박테리아에서 효소 유도 바이오필름 억제의 정량화

초록

출처: Tay, S. B. 외 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 병원성 박테리아에서 바이오필름 생체량을 정량화하는 방법을 시연하며, 처리되지 않은 대조군과 쿼럼 소환 효소로 처리된 샘플을 비교합니다. 이 효소는 초기 배양 과정에서 박테리아의 신호를 방해하여 세포 부착을 감소시킵니다. 세척 후 추가 배양 후 대조 우물은 밀도가 높은 바이오필름을 형성하는 반면, 처리된 우물은 형성이 감소합니다. 양이온염료를 사용해 바이오필름을 염색하고, 흡수도를 측정하여 생체량을 평가합니다.

프로토콜

1. A. baumannii S1의 바이오필름 형성에 대한 결정 자비 정량

1. 5mL 양의 아시네토박터 바우만니 S1(A. baumannii) 배양물을 라이소제니 육수(LB)(트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L)를 30°C에서 진동 인큐베이터(220 rpm)에서 16시간 동안 배양합니다.
2. A. baumannii S1의 배양을 600 nm(OD₆₀₀)에서 원하는 광학 밀도 0.8로 조정합니다. 96웰 플레이트를 사용해 박테리아 배양(1:100 희석)을 10 μl의 정제된 GKL 효소(40 mg/ml)가 포함된 신선한 LB에 접종합니다; 새로운 배양의 최종 용량은 100 μl입니다.
3. 대조군 배양도 준비하세요; 이 과정에는 효소가 들어있지 않습니다. 원하는 복제 수를 얻기 위해 유사한 조건을 반복합니다.
4. 접시를 뚜껑으로 덮고 밀봉된 10L 플라스틱 용기에 넣으세요. 플레이트를 30°C에서 3시간 배양한 후 배지를 부드럽게 제거하세요.
5. 웰에 신선한 LB 배지 100μl을 추가하고 30°C에서 21시간 배양합니다.
6. 두 번째 배양 기간이 끝난 후에는 모든 배지를 부드럽게 제거하세요. 플랑크톤 박테리아 세포를 200μl 멸균수로 세척하세요. 세척 시 세포에 미치는 손상이 최소화되도록 하세요.
7. 각 웰에 1% 크리스탈 바이올렛 용액 100μl을 추가하고 상온에서 15분간 배양합니다. 200μl 멸균수로 우물을 세척하여 결정 보라색 용액을 제거합니다. 세척을 두 번 더 반복하세요.
8. 각 웰에 33% 아세트산 100μl 부드럽게 흔들며 15분간 배양합니다; 이걸로 염료가 녹아버릴 거야.
9. 600nm에서 결정 바이올렛의 흡광도를 측정하여 형성되는 바이오필름의 양을 정량화합니다. 결정 바이올렛의 양은 형성되는 바이오필름의 양에 비례합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립톤	BD	211705
효모 추출물	BD	212750
96웰 플레이트	코스타	3596
크리스탈 바이올렛	시그마-올드리치	C6158
아세트산	실험실 스캔	PLA00654X	주의: 인화성
시너지 HT 마이크로플레이트 리더	바이오텍