효소 매개 바이오필름 형성 억제의 현미경 평가

초록

출처: 테이, S. B., et.al. 조작된 쿼럼 소환 락토나제를 이용한 병원성 바이오필름의 항병원성 파괴. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 박테리아 세포 신호를 교란하는 효소를 도입하여 바이오필름 형성을 억제하는 과정을 보여줍니다. 이 효소는 박테리아가 세포외 고분자 물질을 생성하는 것을 막아, 유리 바닥 마이크로디시에서 바이오필름 발생을 감소시킵니다. 마지막으로, 형광 렉틴과 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 바이오필름 구조를 시각화합니다.

프로토콜

1. A. baumannii S1 바이오필름의 공초점 레이저 주사 현미경

1. 5ml 양의 A. baumannii S1을 LB에서 30°C, 진동 인큐베이터(220rpm)에서 16시간 동안 배양합니다.

2. A. baumannii S1의 배양을 원하는 OD₆₀₀ 0.8로 조정합니다. 35mm 유리 바닥 μ-접시를 사용해 박테리아 배양(1:100 희석)을 30 μl 정제 GKL 효소(40 mg/ml)가 포함된 신선한 LB에 접종합니다; 뉴 컬처의 최종 권은 1 ML입니다.

3. μ 접시에 뚜껑을 덮고 밀봉된 10L 플라스틱 용기에 넣습니다. μ 접시를 30°C에서 3시간 배양한 후 배지를 부드럽게 제거하세요. 정제된 GKL 효소 30μl과 신선한 배지를 추가하여 총 부피를 1ml로 만듭니다. 30°C에서 21시간 더 배큐하세요.

4. 1.3단계를 반복하고 μ 접시를 30°C에서 추가로 24시간 더 부양합니다. 그 다음, 매체를 부드럽게 제거하세요.

5. 500 μl 5 μg/ml Alex Fluo 488-결합 밀 배아 응집 단백질(WGA)을 행크의 균형 소금 용액(HBSS)에 용해하여 μDish에 추가하고 37 °C에서 30분간 배양합니다; 이로 인해 형성된 바이오필름이 얼룩지게 됩니다. 염색 용액을 제거하고 μ 접시를 2ml HBSS로 세척하세요. 세척 과정을 한 번 더 반복하세요.

6. HBSS에 용해된 3.7% 포름알데히드 500 μl 첨가하여 37 °C에서 30분간 배양; 이렇게 하면 바이오필름이 μ-접시에 고정됩니다. μDish를 2ml HBSS로 한 번 세척한 후 용액을 완전히 제거하세요. 바이오필름으로 고정된 μ 접시는 CLSM 영상 촬영 전 4 °C 어둠 속에서 보관할 수 있습니다.

7. CLSM 영상 및 분석을 위해 63배 배율을 사용하여 각 스택당 0.21 μm 간격으로 97개의 스택을 생성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립톤	BD	211705
효모 추출물	BD	212750
96웰 플레이트	코스타	3596
아세트산	실험실 스캔	PLA00654X	주의: 인화성
μ-접시	이비디	80136
알렉스 플루오 488 결합 WGA	인비트로젠	W11261
행크의 균형 잡힌 소금 용액	인비트로젠	141475095
포름알데히드	시그마-올드리치	F8775	주의: 부식성
시너지 HT 마이크로플레이트 리더	바이오텍
1X-81 역형광 현미경	올림포스