중합효소 연쇄 반응을 이용한 이원 배양에서 당류박테리아 검출

초록

출처: Collins, A. J. 외, 구강에서 공생 당류박테리아의 안정적인 이원 배양 확립. J. Vis. 경험 (2021)

이 영상은 분쇄효소 연쇄 반응(PCR)을 사용해 박티노마이세스 가 있는 이진 배양에서 당류박테리아를 검출하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 숙주-기생충 상호작용의 안정을 확인하기 위해 DNA 증폭과 겔 전기영동을 개략적으로 설명합니다.

프로토콜

1. PCR로 당류박테리아 감염 확인
   1. 5번 통과 후 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 감염을 확인한다. 다섯 개의 통로를 통해 25회 PCR 사이클을 통해 비성장 당류박테리아 세포가 검출 한계 이상으로 고갈되었음을 보장합니다.
   2. PCR 마스터 믹스를 준비하세요. 권장 레시피는 다음과 같습니다: 필요한 각 튜브마다 12.5 μL 2x PCR 버퍼, 0.75 μL 10 μM 전방 프라이머 (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0.75 μL 10 μM 역시 프라이머 (1177R¹³- GAC CTG ACA TCC CCT CCT TC), 1 ΜL 25 MM MgCl_{2, 그리고 9} μL 물. 소용돌이로 섞어.
   3. 마스터 믹스 24 μL을 0.2 mL PCR 튜브에 알리코트합니다. PCR 반응에 1 μL 당류박테리아 감염 배양물을 추가합니다. 튜브를 열사이클러에 넣고 다음 절차를 수행합니다: 95°C에서 5분간 초기 변성, 95°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초, 최종 72°C에서 2분간 신장, 그리고 4°C에서 최종 유지.
   4. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 적재하여 돌리세요. ~600염기로 이루어진 띠는 당류박테리아의 존재를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	피셔 사이언티브	BP160-100
브레인 하트 인퓨전 브로스 (탈수 가루)	벡턴-디킨슨	211059	또는 표적 생물에 적합한 다른 성장 배지
전기영동 전원 공급	바이오-래드	1645052
전기영동 장비	바이오-래드	1704467
고탁 그린 마스터믹스	프로메가	M7122
마스터사이클러 프로 써모사이클러	에펜도르프	950040025	또는 PCR을 위한 동등한 열사이클러
MgCl₂ 용액 25mM	프로메가	A3513
분자생물학 등급의 물	피셔 사이언티브	BP2819100
P-1000 마이크로 피펫	길슨	F123601G
PCR 튜브 0.2 mL	피셔 사이언티브	14-230-205
피펫 팁 - 1000 μL	피셔 사이언티브	02-717-166
SYBR 안전 DNA 젤 염색	서모피셔 사이언티픽	S33102
트립틱 두유 육수 (탈수 분말)	벡턴-디킨슨	211825	또는 표적 생물에 적합한 다른 성장 배지