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참고: 실험 전 과정에서 대식세포는 5%CO2 강제 공기 인큐베이터에서 37°C에서 배양되며, 실험 조작을 위해서만 인큐베이터에서 꺼내며, 이 조작은 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아 관련 작업은 생물학적 안전 2단계 규정에 따라 진행됩니다.
1. 세포 준비 및 세균 감염 (1일차와 2일차)
- 1일차
- 씨앗 2.0 x 10 7개의 골수 유래 대식세포(BMDM)를 145mm 접시에 30ml BMDM + 펜-연쇄상구균 배지에 사용했습니다(표 2). 분석할 박테리아 균주마다 3개의 플레이트를 씨앗 뿌리세요. 5%CO2 강제 공기 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
- 야생형(WT) L. monocytogenes 균주 10403S를 10ml 뇌심장 주입(BHI) 배양지에서, 표준 인큐베이터 30°C에서 하룻밤 박테리아 배양을 시작하세요. 흔들림 없이 기울어진 배양관 위치를 사용하세요.
참고: 이러한 성장 조건은 편모 유전자의 발현을 상향 조절하여 효율적인 감염을 촉진합니다.
- 2일차
- 37 °C에서 미리 가열한 BMDM 배지(펜-스트렙 항생제 제외)(표 2)와 인산 완충 식염수(PBS)를 사용했습니다.
- 대식세포 단층을 25ml의 미리 예열된 PBS와 함께 두 번 세척하여 항생제를 제거하세요. 신선한 BMDM 배양 30ml를 추가하세요.
- 1.5ml의 박테리아 배양물을 PBS로 세척할 때, 박테리아를 14,000 x g에서 원심분리하여 1분간 세척하고>, 상원액을 버린 뒤 피펫팅으로 박테리아를 1.5ml PBS에 부드럽게 재현탁시킵니다. 두 번 반복하세요.
- 각 대식세포판에 야생형 L. monocytogenes 세척 배양액 0.5ml를 감염시킵니다. 여러 판을 사용할 경우, 각 판에 15분 간격으로 감염시키세요. 이 시간 간격은 감염 종료 시 각 플레이트를 개별적으로 채취할 수 있게 해줍니다.
참고: 감염 다수성(MOI)은 감염에 사용되는 박테리아 배양물을 BHI 한천 플레이트에 연속 희석한 배양액을 플레이트링하고, 37 °C에서 24시간 배양 후 콜로니 형성 단위(CFU)를 계수하여 분석합니다. 0.5 ml WT L. monocytogenes 균주 10403S를 사용하면 MOI는 ~ 100(대식세포당 100 박테리아 CFU)이 됩니다. 세포 내 성장에 결함이 있는 박테리아 돌연변이를 분석할 때는 더 높은 MOI를 고려해야 합니다. - 37 °C에서 0.5시간 배양 후 감염된 세포를 PBS로 두 번 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거하고, 미리 데운 30ml BMDM 배지를 추가합니다. 부착된 박테리아는 다음 0.5시간 내에 내부화됩니다.
- 감염 후 1시간 후에 겐타미신 30μl(최종 농도는 50 μg/ml까지 1:1,000)을 추가하여 세포외 박테리아를 죽입니다.
- 진공 출구 포트가 있는 액체 플라스크에 필터 헤드를 올려 필터 장치를 조립합니다. 그 다음 필터 헤드에 0.45 μm 필터를 올려놓고, 실린더 깔때기를 설치한 뒤 금속 클램프로 각 부품을 고정합니다. 얼음처럼 차가운 RNase 없는 물을 준비하세요.
- 감염 후 6시간 후, 감염된 세포에서 다음과 같이 박테리아를 채취합니다. 각 접시를 개별적으로 처리하세요.
참고: 일반적으로 L. monocytogenes 는 대식세포에서 감염 6시간 동안 1-로그 성장을 완료합니다. 더 긴 배양은 박테리아 과증식과 대식세포 사멸을 초래할 수 있으며, 짧은 배양 기간은 훨씬 낮은 박테리아 부하를 초래할 수 있습니다. MOI와 감염 시기를 최적의 조건에 맞추기 위해 조정할 수 있습니다.- 감염된 세포를 PBS로 한 번 세척하세요. 대식세포를 용해하는 데 얼음처럼 차가운 RNase 없는 물 20ml를 추가하세요. 셀 스크레이퍼를 사용해 플레이트에서 세포를 빠르고 조심스럽게 긁어내세요.
- 용해된 세포를 50ml 원뿔형 튜브에 모으세요. 30초 동안 소용돌이. 원심분리기는 800 x g에서 4 °C에서 3분간 돌립니다.
- 진공 시스템을 이용해 필터 장치를 통과시켜 상원액을 통과시킵니다. 핀셋을 사용해 필터를 말아 15ml 원뿔형 튜브로 빠르게 옮기세요. 필터가 있는 튜브를 액체 질소에 급동하세요.
- 1.2.7에 설명된 대로 다음 샘플을 위한 새로운 필터가 포함된 여과 장치를 조립합니다.
- 냉동 필터는 다음 날 -80°C에서 보관하세요. 또는 핵산 추출을 직접 진행할 수도 있습니다.
표 1: DNase 반응 프로토콜.
| RNA | 최대 2 μg(최대 부피 44 μl 내) |
| 10배 DNase 버퍼 | 5 μl |
| RNase 없는 물 | 총 부피 50μl까지 완전 |
| DNAse | 1 μl (1 단위) |
표 2: 매체 및 버퍼 레시피.
| 1. 500ml BMDM+Pen-Strep 매체 (필터 멸균): | |
| 둘벡코의 변형 독수리 미디엄(DMEM) | 235ml |
| 태아 소 혈청(FBS) (54 °C에서 30분 비활성화) | 100ml |
| 대식세포 집락 자극 인자 또는 M-CSF (L-929 조건 배지) | 150ml |
| 글루타민 | 5ml |
| 피루베이트나트륨 | 5ml |
| β-머캅토에탄올 | 0.5ml |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 5ml |
| 총 | 500ml |
| 2. 500ml BMDM (필터 멸균): | |
| DMEM | 235ml |
| FBS (54 °C에서 30분 비활성화) | 100ml |
| M-CSF (L-929 조건 매체) | 150ml |
| 글루타민 | 5ml |
| 피루베이트나트륨 | 5ml |
| β-머캅토에탄올 | 0.5ml |
| 총 | 500ml |
| 3. AE 버퍼 | |
| 아세테이트륨(NaOAc) pH 5.2 | 50 mM |
| 에틸렌디아미네테트라아세트산 (EDTA) | 10 mM |
| RNase 없는 물 | |
| 4. 페놀-클로로포름-IAA | |
| 페놀 | 25ml |
| 클로로포름 | 24ml |
| 아이소-아밀 알코올 | 1ml |
| 5. 클로로포름-IAA | |
| 클로로포름 | 24ml |
| 아이소-아밀 알코올 | 1ml |