감염된 쥐 대식세포에서 채취한 리스테리아 모노사이토제네스 에서 RNA 추출

초록

출처: 시갈, N. 외. 대식세포에서 세포 내 배양된 리스테리아 모노사이토제네스 에서 RNA 정제. J. Vis. 경험 (2016)

이 영상은 감염된 쥐 대식세포에서 분리된 리스테리아 모노사이토제네스 에서 RNA 추출을 시연합니다. 프로토콜은 RNA를 보존하고, 페놀-클로로포름과 열을 이용해 세포를 용해하며, 원심분리로 RNA를 분리합니다. 소금과 에탄올, 그리고 냉 부양은 RNA 침전을 촉진합니다. 생성된 RNA는 숙주가 유도한 유전자 발현을 포착하여 박테리아의 병원성과 적응 전략을 드러냅니다.

프로토콜

1. 핵산 추출

참고: 모든 조작은 페놀과 클로로포름 용액을 연기 후드에서 수행하세요.

1. 각 샘플마다 400μl씩 산성화된 페놀과 클로로포름을 1:1 혼합액으로 준비하세요. 각각 다른 튜브를 섞은 후, 흡입으로 생성된 수층을 빼냅니다. 10% SDS 40 μl을 추가하세요.
2. 필터가 들어 있는 튜브는 얼음 위에 해동해 차갑게 유지하세요. 각 필터 함유관에 650μl의 아세테이트-EDTA(AE) 버퍼(50 mM NaOAc pH 5.2, 10 mM EDTA, RNase 자유수 포함)를 첨가합니다.
3. 다음 단계를 가능한 한 빨리 수행하세요.
   1. 필터가 들어 있는 튜브를 격렬하게 돌려 필터가 튜브 주변으로 휘젓게 하고, 버퍼가 필터를 완전히 세척합니다. 튜브는 항상 얼음 위에 올려서 차갑게 유지하세요.
      참고: 필터에서 박테리아를 완전히 씻어내기 위해 튜브를 뒤집은 상태에서 추가로 소용돌이를 만들어야 할 수도 있습니다.
   2. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 과정 종료 시점에 서스펜션을 1분 정도 1분 정도 돌리는 것이 유용할 수 있습니다.
4. 박테리아 함유 완충제를 SDS와 페놀/클로로포름 혼합물이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 필터에서 잔류 버퍼를 얻기 위해 튜브가 포함된 필터를 다시 1분(120 x g)으로 돌려야 할 수도 있습니다.
5. 모든 1.5ml 튜브를 멀티 튜브 소용돌이 장치에 넣고, 10분 동안 전속력으로 소용돌이를 돌리세요.
6. 튜브를 65°C 열덩어리에 10분간 부화시킵니다. 최대 속도(> 14,000 x g)로 5분간 원심분리기를 사용하세요.
7. 각 튜브에서 수층(약 400 μl)을 3M 아세테이트 나트륨 40 μl(pH 5.2)과 100% 에탄올 1.0 mL가 들어있는 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 각 튜브를 철저히 보텍스하세요.
   참고: 이 단계에서 침전된 펠릿의 시각화를 개선하기 위해 글리코겐을 추가할 수 있습니다.
8. 샘플을 -80°C에서 1시간 배양하세요. 또는 샘플을 -20°C에서 하룻밤 배양할 수도 있습니다. 그 후 4°C에서 최대 속도(> 14,000 x g)로 20분간 원심분리합니다.
9. 각 튜브에서 에탄올(상층)을 조심스럽게 흡입하세요. 각 샘플에 500μl 차가운 70% 에탄올을 추가하고 완전히 소용돌이 추출합니다. 원심분리기는 4°C에서 최대 속도(> 14,000 x g)로 20분간 작동.
10. 각 튜브에서 에탄올을 조심스럽게 흡입하세요. 진공 증발기를 사용해 약 2분간 가열 없이 건조합니다. 샘플을 과도하게 건조하지 마세요.
11. 각 샘플에 25μl RNase 없는 물을 첨가합니다. 실온에서 20분간 부화하세요. 조심스럽게 소용돌이와 스핀다운.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
리스테리아 모노사이토제네스 10403S
H2O, RNAse 자유	써모 사이언티픽	10977-015	DEPC 처리된 물도 사용할 수 있습니다
페놀 포화 pH 4.3	피셔	BP1751I-400
클로로포름	피셔	BP1145-1
아이소-아밀 알코올	시그마-올드리치	W205702
아세테이트 나트륨	시그마-올드리치	W302406
EDTA	시그마-올드리치	EDS
SDS 10%	시그마-올드리치	L4522
에탄올 절대	메르크 밀리포어	1070174000
MF-밀리포어 필터 45mm, 0.45 μm	메르크 밀리포어	HAWP04700
소용돌이-지니 2	과학 산업	모델 G560E
65 °C 히트 블록	써모 사이언티픽
4 °C 테이블 원심분리기	에펜도르프	5417R
멸균 피펫, 25ml	그라이너
팔콘 튜브, 50ml	그라이너
1.7ml 튜브, RNase 무첨가	악시겐	MCT-175-C
스피드백 시스템	써모 사이언티픽	SPD131DDA