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동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.
1. 요로병원성 대장균 (UPEC) 박테리아 접종 제제
- 요로감염(UTI89) 접종 준비 (접종일 72시간 전부터 시작)
- 냉동 육수에서 추출한 LB(루리아-베르타니) 한천 플레이트에 UTI89를 스트릭 처리했습니다. 37°C에서 하룻밤 배양하세요. 군집을 하나 골라서 125ml 플라스크에 10ml의 LB에 접종하세요. 37°C에서 24시간 정적으로 배양하세요.
- 10 μl 10 μl 양을 10 ml LB에 새 125ml 플라스크에 37 °C에서 24시간 더 접종합니다.
- 3ml(균주와 원하는 접종량에 따라 달라짐)를 멸균 1.5ml 튜브에 옮기고 7,000 x g에서 원심분리기에 3분간 넣고, 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 다시 한 번 재현탁하고 원심분리기를 합니다. 박테리아 펠릿을 1 mL 1x PBS에 재현탁합니다.
- 박테리아의 광학 밀도를 측정하고 원하는 접종구 밀도에 맞게 농도를 조정합니다. 사용되는 접종의 표준 농도는 107 박테리아이며; 하지만 연구 설계에 따라 다를 수 있습니다.
2. 박테리아 예방접종
- 작업대를 70% 에탄올로 청소하고 흡수지로 덮으세요(또는 멸균 유동 후드를 사용).
- 준비된 박테리아 접종액을 최대 0.9ml까지 1ml 투버쿨린(TB) 주사기에 흡혈하세요(기포 제거). 10(PE10) 크기의 폴리에틸렌 튜브가 포함된 준비된 멸균 접종 바늘을 접종물이 담긴 주사기에 부착한 후, 폴리에틸렌 튜브를 멸균 절단합니다.
참고: 방광을 뚫지 않도록 바늘 끝 위에 1mm 정도의 튜브를 남겨두세요. - 1인치 정사각형 파라필름 조각을 잘라내고 그 위에 약 10센트 크기의 수술용 윤활제를 조금 바릅니다.
- 암컷 C3H/HeN 마우스는 제조사 프로토콜에 따라 증기 필터에 넣어 의식을 잃었지만 정상적으로 호흡할 때까지 마취하세요(초당 1호흡).
주의: 이소플루란은 흡입 마취제입니다. 환기가 잘 되는 곳에서 사용하고 흡입을 최소화하세요. - 쥐를 증기에서 꺼내 종이 타월 위에 등을 대고 놓고 다리를 벌리세요.
- 마취를 유지하기 위해 코 콘(증기 발생기에 연결된 튜브, 일부 베이퍼라이저에 포함된 통제된 이소플루란 용량을 제공하는 튜브)로 덮으세요.
- 방광을 부드럽게 촉진하여 소변을 유도하고 방광이 배출되도록 하세요. 요도 주변 부위를 100% 에탄올 물티슈로 닦으세요. 접종 바늘/주사기를 먼저 수술용 윤활제에 살짝 찍어 넣으세요.
- 각 쥐에게 50μl의 박테리아 용액을 접종하여 접종 바늘을 요도에 약 12mm 삽입한 후 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 방광에 접종을 분사합니다(10 μl/sec). 접종 바늘을 쥐에서 빼세요.
참고: 접종을 시작할 때 요도 입구에 접종이 즉시 다시 들어오면 바늘이 부적절하거나 완전하지 않다는 신호입니다. - 코 콘에서 쥐를 떼어내어 다시 우리에 넣으세요. 각 마우스에 대해 2.3-2.8단계를 반복합니다. 접종 조건/균주를 변경할 때는 주사기와 접종 바늘을 승인된 샤프스 용기에 버리고 2.2단계부터 다시 시작하세요.
참고: 요로병원성 병원체 접종은 일반적으로 심한 통증 증상을 유발하지 않습니다. 하지만 드물게, 병원체를 다량으로 투여하면 발열, 음식과 물 섭취 감소, 이상 행동이 발생할 수 있습니다. 실험 기간 내내 동물 건강을 모니터링해야 합니다. 명백한 통증 증상이 감지되면 부프레노르핀(0.05−0.1 mg/kg)과 같은 진통제를 피하 투여할 수 있습니다.
3. 세포 내 박테리아 군집(IBC) 열거
- 방광을 무균적으로 제거한 후 실리콘 바닥이 있는 6웰 플레이트에 1x PBS를 넣어 놓으세요. 실리콘 엘라스토머 키트를 사용해 각 웰에 약 1cm의 실리콘을 부어 플레이트를 준비할 수 있습니다. 가위로 방광을 반으로 잘라.
- 작은 금속 핀을 사용해 방광을 부드럽게 펼쳐 방광 루멘이 위를 향하게 합니다. 핀은 방광 부위의 가장 바깥쪽 가장자리에 배치하여 요로피가 최대한 노출되도록 하세요.
- 펼친 후에는 1x PBS로 방광을 한 번 부드럽게 씻어주세요. 피펫으로 1x PBS를 제거하세요. 방광을 교정하려면 벌어진 방광 전체를 덮을 만큼 3% 파라포름알데히드를 충분히 첨가하세요.
주의: 파라포름알데히드는 발암성을 가지고 있습니다. 장갑을 포함한 적절한 보호 장비를 항상 착용해야 합니다. 폐기는 기관 지침을 따라야 합니다. - 실온에서 1시간 동안 배양하세요. 파라포름알데히드 용액을 제거하세요. PBS 1배로 한 번 세척하세요.
- LacZ 세척액(2 mM MgCl2, 0.01% 디옥시콜레이트 나트륨, 0.02% 논이데트-p40 1x PBS에 함유)으로 세 번, 5분씩 세척합니다.
- 세척액을 제거하고 방광을 덮을 만큼 충분한 LacZ 염색제(9.5ml LacZ 세척액, 0.4ml 25mg/ml X-gal, 100 mM K-페로시안화물/K-페리시안화물 0.1ml)를 추가하세요. 빛을 차단한 상태에서 30°C에서 하룻밤 부양하세요.
- 인큐베이터에서 펼쳐진 방광을 제거하고, 해부 망원경으로 40-60배 배율로 시각화한 파란색 펀크타 형태의 IBC를 관찰하세요.
참고: 때때로 쥐가 요도 아래에 관을 삽입하기 전에 소변을 볼 수 있습니다. 이 경우에는 다시 소변을 채취하기 전에 15-20분을 기다리세요.