감염된 쥐 방광 내 세포 내 박테리아 군집 시각화

초록

출처: Conover, M. S. 외, 마우스 모델에서 요로감염 및 CAUTI의 확립 및 특성화. J. Vis. 경험 (2015)

이 영상은 β-갈락토시다아제 발현 대장균에 감염된 마우스 방광 조직에서 세포 내 박테리아 군집(IBCs)을 검출하는 과정을 보여줍니다. 조직 고정, 투과화 및 X-gal 염색 후, IBCs는 해부 현미경 아래에서 파란색 천점으로 나타나 요로 감염 시 세균 침입을 확인한다.

프로토콜

동물 모델이 포함된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 심사 위원회에서 검토되었습니다.

1. 요로병원성 대장균 (UPEC) 박테리아 접종 제제

1. 요로감염(UTI89) 접종 준비 (접종일 72시간 전부터 시작)
   1. 냉동 육수에서 추출한 LB(루리아-베르타니) 한천 플레이트에 UTI89를 스트릭 처리했습니다. 37°C에서 하룻밤 배양하세요. 군집을 하나 골라서 125ml 플라스크에 10ml의 LB에 접종하세요. 37°C에서 24시간 정적으로 배양하세요.
   2. 10 μl 10 μl 양을 10 ml LB에 새 125ml 플라스크에 37 °C에서 24시간 더 접종합니다.
   3. 3ml(균주와 원하는 접종량에 따라 달라짐)를 멸균 1.5ml 튜브에 옮기고 7,000 x g에서 원심분리기에 3분간 넣고, 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 다시 한 번 재현탁하고 원심분리기를 합니다. 박테리아 펠릿을 1 mL 1x PBS에 재현탁합니다.
2. 박테리아의 광학 밀도를 측정하고 원하는 접종구 밀도에 맞게 농도를 조정합니다. 사용되는 접종의 표준 농도는 10⁷ 박테리아이며; 하지만 연구 설계에 따라 다를 수 있습니다.

2. 박테리아 예방접종

1. 작업대를 70% 에탄올로 청소하고 흡수지로 덮으세요(또는 멸균 유동 후드를 사용).
2. 준비된 박테리아 접종액을 최대 0.9ml까지 1ml 투버쿨린(TB) 주사기에 흡혈하세요(기포 제거). 10(PE10) 크기의 폴리에틸렌 튜브가 포함된 준비된 멸균 접종 바늘을 접종물이 담긴 주사기에 부착한 후, 폴리에틸렌 튜브를 멸균 절단합니다.
   참고: 방광을 뚫지 않도록 바늘 끝 위에 1mm 정도의 튜브를 남겨두세요.
3. 1인치 정사각형 파라필름 조각을 잘라내고 그 위에 약 10센트 크기의 수술용 윤활제를 조금 바릅니다.
4. 암컷 C3H/HeN 마우스는 제조사 프로토콜에 따라 증기 필터에 넣어 의식을 잃었지만 정상적으로 호흡할 때까지 마취하세요(초당 1호흡).
   주의: 이소플루란은 흡입 마취제입니다. 환기가 잘 되는 곳에서 사용하고 흡입을 최소화하세요.
5. 쥐를 증기에서 꺼내 종이 타월 위에 등을 대고 놓고 다리를 벌리세요.
6. 마취를 유지하기 위해 코 콘(증기 발생기에 연결된 튜브, 일부 베이퍼라이저에 포함된 통제된 이소플루란 용량을 제공하는 튜브)로 덮으세요.
7. 방광을 부드럽게 촉진하여 소변을 유도하고 방광이 배출되도록 하세요. 요도 주변 부위를 100% 에탄올 물티슈로 닦으세요. 접종 바늘/주사기를 먼저 수술용 윤활제에 살짝 찍어 넣으세요.
8. 각 쥐에게 50μl의 박테리아 용액을 접종하여 접종 바늘을 요도에 약 12mm 삽입한 후 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 방광에 접종을 분사합니다(10 μl/sec). 접종 바늘을 쥐에서 빼세요.
   참고: 접종을 시작할 때 요도 입구에 접종이 즉시 다시 들어오면 바늘이 부적절하거나 완전하지 않다는 신호입니다.
9. 코 콘에서 쥐를 떼어내어 다시 우리에 넣으세요. 각 마우스에 대해 2.3-2.8단계를 반복합니다. 접종 조건/균주를 변경할 때는 주사기와 접종 바늘을 승인된 샤프스 용기에 버리고 2.2단계부터 다시 시작하세요.
   참고: 요로병원성 병원체 접종은 일반적으로 심한 통증 증상을 유발하지 않습니다. 하지만 드물게, 병원체를 다량으로 투여하면 발열, 음식과 물 섭취 감소, 이상 행동이 발생할 수 있습니다. 실험 기간 내내 동물 건강을 모니터링해야 합니다. 명백한 통증 증상이 감지되면 부프레노르핀(0.05−0.1 mg/kg)과 같은 진통제를 피하 투여할 수 있습니다.

3. 세포 내 박테리아 군집(IBC) 열거

1. 방광을 무균적으로 제거한 후 실리콘 바닥이 있는 6웰 플레이트에 1x PBS를 넣어 놓으세요. 실리콘 엘라스토머 키트를 사용해 각 웰에 약 1cm의 실리콘을 부어 플레이트를 준비할 수 있습니다. 가위로 방광을 반으로 잘라.
2. 작은 금속 핀을 사용해 방광을 부드럽게 펼쳐 방광 루멘이 위를 향하게 합니다. 핀은 방광 부위의 가장 바깥쪽 가장자리에 배치하여 요로피가 최대한 노출되도록 하세요.
3. 펼친 후에는 1x PBS로 방광을 한 번 부드럽게 씻어주세요. 피펫으로 1x PBS를 제거하세요. 방광을 교정하려면 벌어진 방광 전체를 덮을 만큼 3% 파라포름알데히드를 충분히 첨가하세요.
   주의: 파라포름알데히드는 발암성을 가지고 있습니다. 장갑을 포함한 적절한 보호 장비를 항상 착용해야 합니다. 폐기는 기관 지침을 따라야 합니다.
4. 실온에서 1시간 동안 배양하세요. 파라포름알데히드 용액을 제거하세요. PBS 1배로 한 번 세척하세요.
5. LacZ 세척액(2 mM MgCl₂, 0.01% 디옥시콜레이트 나트륨, 0.02% 논이데트-p40 1x PBS에 함유)으로 세 번, 5분씩 세척합니다.
6. 세척액을 제거하고 방광을 덮을 만큼 충분한 LacZ 염색제(9.5ml LacZ 세척액, 0.4ml 25mg/ml X-gal, 100 mM K-페로시안화물/K-페리시안화물 0.1ml)를 추가하세요. 빛을 차단한 상태에서 30°C에서 하룻밤 부양하세요.
7. 인큐베이터에서 펼쳐진 방광을 제거하고, 해부 망원경으로 40-60배 배율로 시각화한 파란색 펀크타 형태의 IBC를 관찰하세요.
   참고: 때때로 쥐가 요도 아래에 관을 삽입하기 전에 소변을 볼 수 있습니다. 이 경우에는 다시 소변을 채취하기 전에 15-20분을 기다리세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
감염 물질:
이소플루루란 – 등각(isothesia)	버틀러 샤인	29405	250ml
투명 유리 직선 병	킴블 체이스	5413289V 21
스테인리스 스틸 차 인퓨저	셰프스-아마존		Schefs의 프리미엄 잎차 인퓨저 - 스테인리스 스틸 - 대용량 -
비멸균 면뭉치	피셔브랜드	22-456-880
50ml 팔콘 튜브	VWR	89039-660
Isotec 3 - 증발기	오메다	1224478
귀 펀치	피셔 사이언티브	13-812-201	(필요할 때)
베타딘 용액	베타딘 용액		10% 포비디-요오드 국소용액
면봉	피셔 사이언티브	22-037-924	6인치
벤치용 기저귀	피셔브랜드	14206 63	흡수성 언더패드 (20"X36"매트)
수술용 윤활제	서길루브	0281-0205-36
해부 가위	파인 사이언스 툴스, INC	14084-08
마이크로 애드손 겸자	파인 사이언스 툴스, INC	11018-12
1ml 주사기	BD	309659	투버쿨린 슬립 팁
파라필름	베미스	PM996	4인치 x 125피트
에펜도르프 선반	피셔브랜드	05-541-1
에펜도르프 진공관	중산과학	AVX-T-17-C
IBC 자료:
6웰 조직 배양 테스트 플레이트	테크노 플라스틱 프로덕츠	92006
핀	파인 사이언스 툴즈	26002-20
실가르드 184	다우 코닝	3097358-1004	실리콘 엘라스토머 키트
X-갈(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-D-갈락토사이드)	인비트로젠	15520-034	울트라퓨어
N, N-디메틸포름아마이드	시그마 올드리치	D4551
염화마그네슘	시그마 올드리치	M8266
디옥시콜레이트 나트륨	시그마 올드리치	D6750
논니데-P40	로슈	11754599001	옥틸페놀폴리(에틸렌글리콜레터)n
헥사시아노페르산칼륨(II) 삼수화물 (K-페로시안화물)	시그마 올드리치	P3289
헥사시아노페레이트 칼륨(III) (K-페리시안화물)	시그마 올드리치	60299