구강 병원 연구를 위한 박테리아-곰팡이 교차 생물막 구축

초록

출처: Schlafer, S, Frost Kristensen, M. 교차 생물막에서 공초점 현미경을 이용한 세포외 pH 모니터링. J. Vis. 경험 (2020)

이 영상은 구강 환경에서 Streptococcus mutans 와 Candida albicans 교차 생물막을 배양하여 박테리아-곰팡이 상호작용을 모델링하는 과정을 시연하며, 구강 병인에서 미생물 시너지, 글루칸 매개 부착, 산성 병원성 연구를 가능하게 합니다.

프로토콜

샘플 채취와 관련된 모든 절차는 기관의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 왕국 간 생물막 배양

1. 호기성 조건에서 37°C의 혈액 한천 플레이트에서 Streptococcus mutans(S. mutans, DSM 20523 )와 Candida albicans(C. albicans) NCPF 3179를 배양합니다.
2. 각 유기체의 단일 콜로니를 5mL 뇌심장 주입(BHI)이 담긴 시험관에 옮깁니다. 37°C의 호기성 조건에서 18시간 동안 재배하세요.
3. 1,200 x g에서 5분간 배양액을 원심분리하세요. 상청액을 버리고 세포를 생리식염수에 다시 현탁한 후, C. albicans(~10⁷ cells/mL)와 S. mutans(~10⁸ cells/mL)의 경우 OD_{550 nm}를 0.5로 조정합니다. S. mutans 현탁액을 멸균 생리식염수(~10⁷ cells/mL)로 1:10으로 희석합니다.
4. 피펫 50 μL의 멸균 침액을 광학 바닥 96웰 플레이트의 웰에 주입하여 현미경 검사를 수행합니다. 37°C에서 30분간 배양하세요. 100μL 멸균 생리식염수로 웰을 3번 세척하세요. 우물을 비워라.
5. 각 우물에 100 μL C . albicans 현탁액을 추가하세요. 37°C에서 90분간 배양하세요. 멸균 생리식염수로 3번 세척하세요.
   참고: 세척 중에 우물을 완전히 비우지 마세요. 과도한 전단력을 피하기 위해 20 μL 저장소를 남겨두세요.
6. 각 웰에 56°C에서 30분간 불활성화된 열 비활성화된 태아 소 혈청 100 μL을 추가합니다. 37°C에서 2시간 배양하세요. 멸균 생리식염수로 3번 세척하세요. 웰을 비우고 20 μL의 저수지를 남겨.
7. 각 우물에 100 μL S . mutans 현탁액(1.3단계에서 준비됨)을 추가합니다. 5% 자당을 포함한 BHI 150 μL를 추가합니다. 37 °C에서 24시간 이상 배양하세요. 오래된 바이오필름을 배양할 때는 매일 배지를 신선한 BHI로 바꾸세요. 크로스 킹덤 바이오필름 성장 단계가 끝나면 멸균 생리식염수로 5회 세척하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
혈액 한천 플레이트	스테이텐스 혈청 연구소	677
뇌심장 주입	옥소이드	CM1135
뇌심장 주입 + 5% 자당	BDH 실험실 용품	10274
칸디다 알비칸	국립 병원성 균류 컬렉션	NCPF 3179
태아 소 혈청	깁코 라이프 기술	10270
GS-6R 냉장 원심분리기	벡맨	해당 없음
μ-플레이트 96 웰 블랙	이비디	89626
멸균 생리식염수	VWR	6404
연쇄상구균 뮤탄스	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
비스 분광광도계 V-3000PC	VWR	해당 없음